劉 樂，丁 一，王紫玄，房耀維，王淑軍,2，呂明生,*

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

右旋糖苷酶（EC.3.2.1.11）水解α-1,6糖苷鍵產(chǎn)生異麥芽寡糖，廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥行業(yè)[1-5]。在制糖工業(yè)中，該酶被用于降低甘蔗汁黏度、減少管道堵塞、提高糖產(chǎn)量和品質(zhì)[6-10]。在化工領(lǐng)域，該酶被用于合成色譜填料、增稠劑、乳化劑等[11]。在口腔保健醫(yī)學(xué)中，該酶用于清除牙菌斑，預(yù)防齲齒、牙結(jié)石和牙周病[1]。在醫(yī)藥行業(yè)，該酶可用于生產(chǎn)代血漿的低分子質(zhì)量右旋糖酐。我國2012年批準(zhǔn)右旋糖苷酶為食品添加劑，其在食品加工中應(yīng)用將越來越廣泛。

本實(shí)驗(yàn)室從海泥中篩選出1 株產(chǎn)右旋糖苷酶的氧化節(jié)桿菌KQ11（Arthrobacter oxydans KQ11）[12-13]，對右旋糖苷酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，構(gòu)建了該酶的基因工程菌[14-17]。目前，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data base，PDB）中已解析結(jié)構(gòu)的右旋糖苷酶僅有：Penicillium minioluteum產(chǎn)的右旋糖苷酶（PmDex），包含氨基酸殘基574 個(gè)[18]；Streptococcus mutans產(chǎn)的右旋糖苷酶（SmDex），包含氨基酸殘基643 個(gè)[19]；Thermoanaerobacter pseudethanolicus產(chǎn)的右旋糖苷酶（TpDex），包含氨基酸殘基1 236 個(gè)[20]。它們分屬糖苷酶49和66家族[21-22]，催化機(jī)制分別為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)和構(gòu)型保持[18-19]。相比其他糖苷酶，右旋糖苷酶的結(jié)構(gòu)與功能信息過少。氧化節(jié)桿菌右旋糖苷酶（AoDex）催化域的研究鮮見報(bào)道。

通過生物信息學(xué)方法對酶蛋白結(jié)構(gòu)解析，定點(diǎn)突變催化域中的保守氨基酸殘基，是對催化域關(guān)鍵氨基酸研究的主要方法[20]。右旋糖苷酶在食品加工中應(yīng)用受到其酶學(xué)性質(zhì)的限制。制糖行業(yè)要求酶活力高、耐高溫、穩(wěn)定性好的右旋糖苷酶[6]。在代血漿右旋糖酐生產(chǎn)中，需要控制產(chǎn)物分子質(zhì)量和催化方向，通過對酶進(jìn)行分子改造可以實(shí)現(xiàn)。本研究通過同源比對和結(jié)構(gòu)預(yù)測以及對關(guān)鍵氨基酸定點(diǎn)突變，研究AoDex的催化域及其關(guān)鍵氨基酸殘基，為該酶的結(jié)構(gòu)解析和進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏，該菌株的宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3），質(zhì)粒為pColdIII，目的基因?yàn)閬碜訩Q11的1 923 bp右旋糖苷酶基因。

感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）杭州寶賽生物科技有限公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒杭州寶賽生物科技有限公司；快速定點(diǎn)突變試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；HisPur Ni-NAT Superflow Agarose 美國Thermo Fisher公司；密理博超濾管 美國密理博公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 美國Sigma公司；引物合成及DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PowerPac? HC電泳儀 美國Bio-Rad公司；DG-3A微型水平凝膠電泳槽 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；PyxisTM凝膠分析系統(tǒng) 南京思普金生物科技有限公司；Q5000微量分光光度計(jì) 美國Quawell公司；JY92-IIN超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒提取

E. coli KQ11-ColdIII在LB培養(yǎng)基（蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%，50 μg/mL氨芐，pH 7.5），37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.3.2 右旋糖苷酶催化域關(guān)鍵氨基酸的選擇

AoDex氨基酸序列提交JPred在線服務(wù)器（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/），通過對數(shù)據(jù)庫的搜索，發(fā)現(xiàn)該序列與朱黃青霉（P. minioluteum）（PDB code：1OGO）[18]右旋糖苷酶（PmDex）和黑曲酶（Aspergillus niger）ATCC9642所產(chǎn)的異普魯蘭酶（PDB code：2Z8G）[22]的序列最為相近，同屬GH-49，酶蛋白表面的縫隙中的氨基酸殘基構(gòu)成了催化域。對AoDex氨基酸序列與PmDex氨基酸序列進(jìn)行比對分析。

根據(jù)PDB和碳水化合物活性酶維基（carbohydrate active enzymes pedia，CAZy）數(shù)據(jù)庫的記載，PmDex催化機(jī)制為構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，催化區(qū)域?yàn)镼374～D396。選擇與PmDex催化區(qū)域內(nèi)保守一致的氨基酸作為AoDex的突變位點(diǎn)。為便于突變酶之間的比較，故將突變位點(diǎn)氨基酸都突變?yōu)楦拾彼帷?/p>

1.3.3 定點(diǎn)突變

用快速定點(diǎn)突變試劑盒以未突變的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)體系（50 μL）：Fast Alteration DNA聚合酶（2.5 U/μL）1.5 μL；5×FastAlteration Buffer 10 μL；未突變質(zhì)粒模板2 μL；正向引物（10 μmol/L）2 μL；反向引物（10 μmol/L）2 μL；ddH2O 32.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火10 s；68 ℃延伸4 min；共18 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min；10 ℃保存。50 μL PCR產(chǎn)物加入1 μLDpnI在37 ℃孵育1 h，消化模板。吸取10 μL消化產(chǎn)物加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5α，冰浴30 min，42 ℃準(zhǔn)確熱激90 s，冰浴2 min。加入700 μL無抗LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)1 h。吸取300 μL培養(yǎng)后的混合物均勻涂布在含氨芐抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性菌落培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 定點(diǎn)突變引物Table 1 Primer sequences used for site-directed mutation

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)酶與純化

將含有突變質(zhì)粒的E. coliBL21（DE3）接種到含50 μg/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)5.5 h活化，5%接種含氨芐LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD值0.8左右（15 h左右）。加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)48 h。菌懸液12 396×g離心20 min，沉淀用20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl溶液1 mL重懸，超聲破碎6 min，12 396×g離心20 min，收集上清液。用Ni-NAT柱對發(fā)酵上清液進(jìn)行純化，將咪唑洗脫緩沖液用截留分子質(zhì)量為10 kDa的密理博超濾管進(jìn)行濃縮，檢測蛋白濃度，進(jìn)行15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），檢測酶活力。

1.3.5 右旋糖苷酶活力測定

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進(jìn)行酶活力測定[15]，取50 μL酶液于10 mL試管中，加入150 μL 3%的右旋糖苷酐乙酸乙酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 5.5），在45 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冷卻，加入200 μL DNS終止反應(yīng)，沸水中顯色5 min。加入3 mL蒸餾水，混勻，測定540 nm吸光度，數(shù)值代入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：在pH 5.5、45 ℃條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol麥芽糖所需的酶量，即為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 突變酶的酶作用溫度和pH值的測定

將酶分別置于25～70 ℃的水浴鍋中測定酶活力。酶作用pH值研究首先配制50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），50 mmol/L Britton-Robinson緩沖溶液（pH 6.5、7.0、7.5、8.0），然后用不同的緩沖液配制含3%的右旋糖酐底物溶液，在45 ℃水浴中測定不同pH值條件下的酶活力。

1.3.7 結(jié)構(gòu)分析與同源建模

采用Expasy提供的Prot Param程序?qū)τ倚擒彰傅陌被釟埢鶖?shù)目、組成、原子組成、蛋白相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及疏水性平均值等參數(shù)進(jìn)行在線分析。

采用SOPMA對該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

使用SWISS-MODEL對該蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并利用Procheck和Verify_3D對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評估。使用PyMol2.7軟件展示三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

序列比對與使用DNAMAN 6.0處理并展示，數(shù)據(jù)處理使用Origin 2017，氨基酸相互作用處理使用LigPlus。

2 結(jié)果與分析

2.1 催化位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

圖1 AoDex氨基酸序列與PmDex氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment between AoDex and PmDex

AoDex與PmDex的氨基酸序列比對結(jié)果見圖1，AoDex的Q418～D440與PmDex的催化區(qū)域Q374～D396中的催化位點(diǎn)具有高度保守性（47.83%的氨基酸序列一致性，圖2）。PmDex催化區(qū)域的3 個(gè)天冬氨酸殘基D376、D395和D396是該糖苷酶家族催化域的保守殘基。AoDex的氨基酸序列的Q418、T419、D420、G421、E423、Y425、S428、F434、N438、D439與PmDeX催化區(qū)域的氨基酸殘基一致。與PmDex的Q374對應(yīng)的AoDex的Q418，PmDex的D376、D395和D396對應(yīng)AoDex的D420、D439和D440推斷為催化氨基酸。在糖苷酶中，天冬氨酸和谷氨酸通常都可為催化域中的廣義酸堿對，因此推斷E423也有可能參與催化反應(yīng)。

圖2 AoDex 418～440位氨基酸序列與PmDex 374～396位氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid residue 418-440 in AoDex and 374-396 in PmDex

2.2 定點(diǎn)突變檢測結(jié)果

定點(diǎn)突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E. coliDH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序，5 個(gè)選定的突變位點(diǎn)都成功地突變?yōu)樵O(shè)計(jì)的堿基。在定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)參考了不同文獻(xiàn)[20]，Q418、D420、E439是把突變位點(diǎn)放在引物中間，而E423、D440的引物則是突變位點(diǎn)偏向一邊。在定點(diǎn)突變試驗(yàn)中，如試驗(yàn)多次沒有達(dá)到預(yù)期結(jié)果時(shí)，可通過改變引物設(shè)計(jì)策略，以確保實(shí)驗(yàn)成功。

2.3 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

為檢測突變后的基因是否正常表達(dá)，對5 個(gè)突變型37 ℃發(fā)酵，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)Ni-NAT柱純化，使用SDS-PAGE檢測。如圖3所示，表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量在66 kDa左右，與AoDex的分子質(zhì)量是一致的，5 個(gè)定點(diǎn)突變菌株全部成功表達(dá)了右旋糖苷酶蛋白。

圖3 突變右旋糖苷酶SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE profiles of dextranase mutants

2.4 突變型與未突變型右旋糖苷酶活力的測定結(jié)果

如圖4所示，檢測的Q 4 1 8 G D e x酶活力為0.021 U/mL，D420GDex酶活力為0.158 U/mL，E423GDex酶活力為0.060 U/mL，D439GDex酶活力為0.078 U/mL，與AoDex相比幾乎沒有酶活力。檢測到的D440GDex酶活力為50 U/mL，與野生型酶活力相比是一致的。因此，Q418、D420、E423和D439為AoDex催化域的關(guān)鍵氨基酸。當(dāng)分別被替換為甘氨酸時(shí)，失去了催化活性。D440雖然緊鄰D439，在其被替換為甘氨酸時(shí)，并沒有影響到該酶的催化活性。在PmDex的CAZy數(shù)據(jù)中，D376和D396中的1 個(gè)或2 個(gè)都是廣泛堿。D440與PmDex催化域中的保守殘基D396是一致的，本試驗(yàn)表明D440并不是催化域中的廣義堿，由此推斷，PmDex中的D396可能也不是其催化域中的廣義堿。

圖4 定點(diǎn)突變后酶與AoDex酶活力Fig. 4 Enzymatic activity of dextranase mutants and AoDex

2.5 溫度和pH值對突變右旋糖苷酶的影響

圖5 溫度（A）和pH值（B）對D440GDex與AoDex酶活力的影響Fig. 5 Effects of temperature (A) and pH (B) on the activities of D440GDex and AoDex

如圖5A所示，D440GDex的最適酶促反應(yīng)溫度與突變前保持一致，然而，當(dāng)反應(yīng)溫度在25～40 ℃時(shí)，酶的活力顯著提高。突變前，在此溫度間的酶活力分別為5.5、9.5、14.5、20.5 U/mL；突變后，分別為17.7、21.6、33.0、33.8 U/mL。D440GDex活力分別是AoDex活力的321%、227%、228%和165%。D440緊鄰催化區(qū)域，對底物右旋糖苷酐與酶的接合是有影響的。溫度影響到分子動(dòng)力學(xué)，對于酶結(jié)合位點(diǎn)與催化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)影響較大[23-34]。定點(diǎn)突變把天冬氨酸變?yōu)楦拾彼?，在結(jié)構(gòu)上少了一個(gè)帶負(fù)電的乙酸，擴(kuò)大的催化域邊緣處的空間，降低了靜電作用。這可能是突變酶在相對低的溫度下，仍能與底物順暢的結(jié)合。而隨著溫度的逐步升高，這種優(yōu)勢逐漸減小。

從最適pH值的角度（圖5B），AoDex的最適作用pH值為5.5，此時(shí)，酶活力為52 U/mL；而D440GDex的最適作用pH值為6.5，酶活力達(dá)到61 U/mL，酶活力提高了20%。pH值的改變將導(dǎo)致底物和酶分子的帶電狀態(tài)發(fā)生變化。D440GDex在pH 6.5～7.5時(shí)的酶活力都高于AoDex。D440的突變使催化域邊緣少了一個(gè)羰基，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)向堿性方向偏移[25]，經(jīng)計(jì)算，AoDex的等電點(diǎn)為5.19，而D440GDex等電點(diǎn)變?yōu)?.23。對催化域局部而言，減少了1 個(gè)離子鍵或氫鍵作用對其自身或底物的作用。在pH 6.5～7.5之間，D440GDex的催化域結(jié)構(gòu)沒有受到影響。D440GDex在25～40℃酶活力的大幅提高以及最適pH值偏堿都有利于其在口腔護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用[17]。

2.6 AoDex及突變體的結(jié)構(gòu)分析

通過Prot Param程序分析顯示，AoDex由641 個(gè)氨基酸組成，使用SWISS-MODLE進(jìn)行三維同源建模可以得到2 個(gè)AoDex三維模型，利用Chrion對模型進(jìn)行精修，減少結(jié)構(gòu)的能量排斥，選擇總體能量最小的模型作為基本模型（圖6A）。用Procheck檢測優(yōu)化后模型的立體化學(xué)合理性，蛋白的φ、ψ二面角81%在核心區(qū)域，16.7%在額外允許區(qū)，1.2%處于最大允許區(qū)，僅有1.2%在不可信區(qū)域（圖6B）。Verify Protein（Profiles-3D）沒有檢測到不合理Loop區(qū)域。利用Easymodeller 2.0對得到的模型進(jìn)行優(yōu)化。對優(yōu)化后的模型用Errat進(jìn)行評估得分85.940（圖6C）。由此得到的三維模型與PmDex的三維模型相似。

圖6 AoDex結(jié)構(gòu)模擬與模型評估Fig. 6 Structural simulation and model assessment of AoDex

圖6A顯示AoDex有2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)位于N端的β-夾層結(jié)構(gòu)，另一個(gè)是右手平行的β-螺旋結(jié)構(gòu)。在后者的分子表面存在一個(gè)裂隙。預(yù)測的催化位點(diǎn)即位于該縫隙處，見圖6D，Q418、D420、E423、D439和D440的R基均為羧基且暴露在縫隙處外側(cè)，經(jīng)過突變?yōu)楦拾彼?，羧基變?yōu)镠，失去了廣義酸堿提供或是接受H+的作用[26-27]，也就失去了催化作用。依據(jù)同源比對的PmDex的催化域，AoDex的D439應(yīng)為廣義酸，其將與底物+1亞位點(diǎn)的糖苷氧表成一個(gè)氫鍵，D420則為廣義堿，其活化水分子，該水分子再親和攻擊右旋糖苷α-1,6糖苷鍵上的異頭碳，實(shí)現(xiàn)糖苷鍵的斷裂[28]。

圖7 氨基酸殘基相互作用示意圖Fig. 7 Schematic representation of interaction between amino acid residues

突變體Q418GDex和E423GDex酶活力檢測幾乎為零。在PmDex的催化域中也是保守的。谷氨酰胺殘基和谷氨酸殘基雖然不參與催化反應(yīng)，然而，因減少了離子鍵或是氫鍵的作用，造成催化域局部構(gòu)象發(fā)生改變。使用LigPlus對氨基酸的相互作用進(jìn)行分析。如圖7A所示，未突變前Gln418能夠分別與Tyr342和Glu343形成氫鍵，且距離分別為2.93 ?和3.02 ?，Thr419分別與Gln411、Ser414、Tyr416和Asn438形成氫鍵，距離分別3.11、3.11、2.78 ?和2.99 ?；圖7B顯示突變?yōu)镚ly418后，Gly418分別與His391、Thr419、Asp439形成氫鍵，距離分別為2.91、2.88、3.32 ?，Thr419與Gln411、Ser414、Tyr416的距離分別改變3.16、3.03、2.76 ?。圖7C顯示未突變前Glu423能夠與Lys443形成氫鍵，之間的距離為2.65 ?；圖7D顯示突變?yōu)镚ly423后，氫鍵作用消失。催化域中廣義酸堿之間距離改變[29-30]，攻擊糖苷鍵的能力喪失。當(dāng)然，AoDex催化域結(jié)構(gòu)中各個(gè)殘基的作用，最終還需要通過晶體與配體的結(jié)構(gòu)解析才能確定[25]。

3 結(jié) 論

對來自海洋氧化節(jié)桿菌（A. oxydans KQ11）的右旋糖苷酶（AoDex）的催化域及關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行預(yù)測，運(yùn)用定點(diǎn)突變將AoDex催化域中Q418、D420、E423、D439、D440氨基酸變?yōu)楦拾彼?，? 種突變型右旋糖苷酶原核表達(dá)，Q418GDex、D420GDex、E423GDex、D439GDex幾乎沒有酶活力。D440GDex酶活力為50 U/mL，與AoDex一致。D440GDex在25～40 ℃時(shí)的酶活力比突變前提高了2～3 倍；最適pH值也從AoDex的5.5變?yōu)?.5。數(shù)據(jù)表明，Q418、D420、E423、D439四個(gè)氨基酸殘基是AoDex催化域中的關(guān)鍵氨基酸。D440的突變對該酶的性質(zhì)有較大影響，也表明其不是催化域中的廣義堿。本研究為探索AoDex的結(jié)構(gòu)與功能改造提供一定的參考。