李 亞，余沁涵，鮑敏麗，陳燕玲，鄧曉玲

（1.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東 湛江 524088； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】柑橘黃龍病菌（CandidatusLiberibacter asiaticus,CaLas）為韌皮部?jī)?nèi)生的革蘭氏陰性菌，屬于根瘤菌科韌皮部桿菌屬，是引起柑橘黃龍病的重要病原［1］。目前，所有柑橘栽培品種以及各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期都能感染黃龍病菌，病樹往往伴隨著大量落葉和落果，一般植株通常會(huì)在感病幾年后逐漸枯死［2］，因此柑橘黃龍病嚴(yán)重影響了柑橘的產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）屬于夾竹桃科長(zhǎng)春花屬植物，主要作為觀賞和藥用植物。Garnier 等研究證實(shí)夾竹桃科草本植物長(zhǎng)春花可以通過嫁接的方式感染黃龍病菌［3］。而且長(zhǎng)春花染病后葉片上的癥狀更明顯，菌濃度更高，因此常用作研究黃龍病的指示植物和實(shí)驗(yàn)材料［4］。自然界中，植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常受到各種潛在病原生物的侵?jǐn)_，多數(shù)情況下并不表現(xiàn)出癥狀，這主要是因?yàn)樵谶M(jìn)化過程中，植物體內(nèi)形成了復(fù)雜防御機(jī)制。植物可以由防御體系合成各種抗逆代謝物來抵抗各類病原菌的侵染［5］。研究表明，植物正常生長(zhǎng)時(shí)，體內(nèi)活性氧代謝處在一個(gè)低水平的動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)植物受到病原菌的侵染時(shí)，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的代謝平衡被破壞，過量的活性氧引發(fā)細(xì)胞的過氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡［6］。在維持活性氧平衡的過程一系列細(xì)胞保護(hù)酶就起到了非常重要的作用，如超氧化物歧化酶（SOD，Superoxide dismutase）、過氧化物酶（POD，Peroxidase）、多酚氧化酶（PPO，Polyphenol oxidase）及脂氧合酶（LOX，Lipoxygenase）等。因此研究病原菌侵染后寄主植物的防御相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化是了解寄主與病原菌相互作用的機(jī)制、篩選病原感染的分子標(biāo)記以及提高抗病品種選育的準(zhǔn)確性和效率的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，在水稻（Oryza sativa）［7］、小麥（Triticum aestivuml）［8］、棉花（Gossypium hirsutum）［9］、絲瓜（Luffa cylindrical）［10］、蘋果（Malus domestica）［11］等各種不同的寄主與稻瘟病，白粉病、棉枯萎病、霜霉病和輪紋病等多種原菌互作系統(tǒng)中，SOD和POD等酶活性的變化趨勢(shì)雖然存在差異，但是其活性的變化規(guī)律仍然反應(yīng)了植物對(duì)病原菌的抵抗能力。在柑橘黃龍病的研究中，病原菌侵染后寄主植物抗性形成的機(jī)制，是近年來研究的重點(diǎn)，也是解決柑橘黃龍病的根本途徑。目前已經(jīng)通過Affymetrix柑橘基因芯片［12］、轉(zhuǎn)錄組學(xué)［13-14］以及同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）［15］研究了黃龍病菌侵染對(duì)柑橘體內(nèi)SOD和POD等基因表達(dá)量的變化。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CaLas基因組中的原噬菌體SC2也能編碼一類POD，從而增強(qiáng)CaLas對(duì)寄主植物的適應(yīng)性,且其在長(zhǎng)春花中的表達(dá)量比柑橘中要高，而在木虱中則被抑制［16-17］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以長(zhǎng)春花作為實(shí)驗(yàn)材料，跟蹤檢測(cè)CaLas感染后一段時(shí)間內(nèi)，長(zhǎng)春花葉、莖和根等不同部位SOD和POD的活性，通過比較不同感染時(shí)間和不同組織中SOD和POD活性的變化，來研究長(zhǎng)春花中SOD和POD的活性與長(zhǎng)春花抵抗CaLas侵染能力的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】長(zhǎng)春花各組織在CaLas感染的不同時(shí)間，SOD和POD的活性變化與長(zhǎng)春花抵抗CaLas侵染是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 2014年3月，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)長(zhǎng)崗山網(wǎng)室內(nèi)將長(zhǎng)春花種子播種于育種盆中，待幼苗長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)移載至直徑15 cm花盆內(nèi)，保證每盆1株，隔天澆水1次。待植株長(zhǎng)至20 cm時(shí)去頂嫁接病芽，同時(shí)以嫁接健康芽的長(zhǎng)春花作為對(duì)照。嫁接后，將所有長(zhǎng)春花苗放置陰涼處避免陽(yáng)光直射，保持嫁接口處芽條濕潤(rùn)，1周后將嫁接苗從陰涼處取出，轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室內(nèi)，隔天澆水1次。

1.1.2 病原材料 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室保存于長(zhǎng)崗山網(wǎng)室內(nèi)，經(jīng)檢測(cè)CaLas陽(yáng)性的長(zhǎng)春花枝條（病原可通過菟絲子從染病柑橘上獲?。┳鳛榧藿佑貌⊙織l。經(jīng)檢測(cè)CaLas陰性的長(zhǎng)春花枝條作為嫁接用健康芽條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法 嫁接病芽后14 d開始，隔天取嫁接點(diǎn)下方葉片，以葉中脈提取DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，以確定染病植株作為陽(yáng)性樣品。最后按嫁接后20、25、30、35、40、45 d共6個(gè)時(shí)間取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取樣品包含3棵陽(yáng)性植株、3棵健康植株，每棵植株的葉（主莖分枝以上部分）、主莖（莖基部-分枝處）和根（莖基本以下）3個(gè)部分作為獨(dú)立的樣品，液氮冷凍后-80℃保存，用于酶活力測(cè)定。

1.2.2 SOD活性測(cè)定 取植物組織0.5 g于預(yù)冷的研缽中，液氮研磨后，加0.05 mol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨勻漿，將勻漿全部傳移至離心管中，至終體積5 mL。提取和測(cè)定參照朱海生等的方法［18］。每克鮮重每分鐘內(nèi)吸光度的變化值表示酶活性大?。║/g·min，F(xiàn)W）。

1.2.3 POD 活性測(cè)定 取植物組織0.5 g于預(yù)冷的研缽中，液氮研磨后加0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.0）研磨成漿，將勻漿全部傳入離心管中，至終體積5 mL。具體提取和測(cè)量方法參照黃相玲等的方法［19］。每克鮮重每分鐘內(nèi)吸光度的變化值表示酶活性大小U/g·min，F(xiàn)W）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用ANOVA的Duncan多重差異分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織間SOD的活性比較

從嫁接后20 d，可以從長(zhǎng)春花葉片中檢測(cè)到黃龍病菌后，開始測(cè)定健康和染病長(zhǎng)春花中SOD含量。從表1可以看出，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，健康葉、莖和根中SOD 酶的活性波動(dòng)不大，葉片中SOD酶的活性都要略高于根莖中SOD酶的活性，而根莖中的SOD 酶活性比較接近。受病原感染的長(zhǎng)春花中SOD 酶活性則表現(xiàn)出不一樣的趨勢(shì)，嫁接后20 d，葉片中的SOD酶活性為559.73 U/g·min（FW），顯著低于莖和根的720.27、702.24 U/g·min（FW）。但隨后根莖中的SOD酶活性逐漸下降，嫁接后30、35 d葉片中SOD酶活性顯著高于莖和根；嫁接后40 d 3個(gè)組織間SOD酶活性均存在顯著差異，葉片中SOD酶活性最高達(dá)564.29 U/g·min（FW），其次為莖447.39 U/g·min（FW），根中SOD酶活性最低為365.12 U/g·min（FW）；嫁接后45 d根中SOD酶活性為349.93 U/g·min（FW）顯著低于葉和莖。

表1 長(zhǎng)春花葉、莖和根中SOD活性比較（U/g·min，F(xiàn)W）Table 1 The activities of SOD in leaves, stems and roots of Catharanthus roseus

2.2 病原感染對(duì)長(zhǎng)春花葉、莖和根SOD活性的影響

從圖1可以看出，與健康對(duì)照相比，染病長(zhǎng)春花葉、莖和根中SOD活性嚴(yán)重偏低。病原感染時(shí)間越長(zhǎng)，葉片SOD活性越低，嫁接后20、25、30 d，葉SOD活性約為對(duì)照的65%，差異顯著，嫁接后45 d SOD活性下降為對(duì)照的61%，差異極顯著。感病長(zhǎng)春花莖部SOD活性除了嫁接后20 d與對(duì)照差異不顯著外，其他各時(shí)期均差異極顯著，嫁接后35 d時(shí)，酶活性最低，為對(duì)照的55%。根部SOD活性的變化規(guī)律與莖部相同，嫁接后20 d與對(duì)照差異不顯著，隨后逐漸下降，從嫁接后25 d開始差異極顯著，到嫁接后45 d酶活性只有對(duì)照的47%。

圖1 染病長(zhǎng)春花葉、莖和根SOD活性Fig. 1 The activity of SOD in leaves, stems and roots of infected Catharanthus roseus

2.3 不同組織間POD酶活性比較

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，健康長(zhǎng)春花的葉、莖和根中，POD活性均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，葉和根POD活性顯著高于莖中POD活性。在染病長(zhǎng)春花的葉、莖和根中，POD活性均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，葉片中酶活性最高出現(xiàn)在嫁接后30 d，酶活性為1 022.5 U/g·min（FW）；莖和根中酶活性最高均出現(xiàn)在嫁接后35 d，酶活性分別為1 008.33、1 129.17 U/g·min（FW），嫁接后30、35 d 3個(gè)組織間POD活性差異顯著；嫁接后40、45 d，根POD活性分別為829.17、732.50 U/g·min（FW），是3個(gè)組織中最高的，顯著高于葉和莖。

表2 長(zhǎng)春花葉、莖和根中POD活性比較（U/g·min，F(xiàn)W）Table 2 The activities of POD in leaves, stems and roots of Catharanthus roseus

2.4 病原感染對(duì)長(zhǎng)春花葉、莖和根POD活性的影響

從圖2可以看出，與健康對(duì)照相比，染病長(zhǎng)春花葉片嫁接后25、30 d POD活性分別為756.94、1 022.5 U/g·min（FW），為對(duì)照的159%和205%，差異顯著；嫁接后45 d酶活性為497.5 U/g·min（FW），為對(duì)照的70%，差異顯著。染病莖和根中POD活性在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)基本高于健康對(duì)照，莖POD活性嫁接后30、40 d分別為602.5、691.5 U/g·min（FW），為對(duì)照的181%和171%，嫁接后35 d POD活性最高為1 008.33 U/g·min（FW），為對(duì)照的254%，差異極顯著。根POD活性嫁接后25、30 d分別為822.5、876.67 U/g·min（FW），為對(duì)照的145%和154%，差異顯著；嫁接后35 d POD活性最高為1 129.17 U/g·min（FW），為對(duì)照的194%，差異極顯著。

圖2 染病長(zhǎng)春花葉、莖和根POD活性Fig. 2 The activities of POD in leaves, stems and roots of infected Catharanthus roseus

3 討論

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中可以通過增加防御相關(guān)酶（SOD、POD和PPO等）的活性來提高對(duì)各種逆境的抵抗能力，增強(qiáng)植物的抗病性［20-22］。大量研究結(jié)果證實(shí)SOD和POD活性的增加能夠明顯提高寄主植物抵抗生物脅迫的能力［23-24］，尤其是病原菌侵染后，抗病品種的SOD和POD的活性往往上升比較快［25-26］。在甘蔗（Saccharum officinarum）與黑穗病［27］、香蕉（Musa nana）與枯萎病［28］的研究中均發(fā)現(xiàn)抗性品種中SOD和POD的活性明顯高于感病品種。

本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)周期內(nèi)健康葉、莖和根中長(zhǎng)春花SOD活性均變化不大，葉片中SOD活性較莖和根部的SOD的活性要高。李玉坤等［29］通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)SOD 系中主要的組成成分Cu/ZnSOD 蛋白定位于葉綠體，主要在植物的綠色組織中表達(dá)，所以東方山羊豆的葉中Cu/ZnSOD表達(dá)量最多, 莖中次之, 根中最少，與本研究結(jié)果一致。黃龍病菌感染之后，莖根中SOD活性逐漸下降，而葉片中相對(duì)波動(dòng)較小，可能與葉片是植物的光合作用中心，代謝活動(dòng)最活躍有關(guān)，病原感染造成植物葉片黃化，整株衰退，光合作用減弱，有機(jī)物合成量下降，莖根所需營(yíng)養(yǎng)不足。分別比較健康和染病植株的葉、莖和根的SOD活性發(fā)現(xiàn)，染病植株3個(gè)組織中SOD的活性均顯著低于健康對(duì)照，說明病原感染對(duì)植物的基礎(chǔ)代謝影響非常大，染病后期隨著葉片黃化程度增加，植株衰退，整體基礎(chǔ)代謝減弱，所有組織中SOD的活性相對(duì)于健康組織均顯著下降。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為病原菌的感染會(huì)導(dǎo)致SOD活性的增加［30-32］，有研究利用Affymetrix柑橘基因組芯片比較抗病和感病柑橘染病后的差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)在SOD基因在抗病品種中高比例上調(diào)表達(dá)，在感病品種中則被抑制［12-13］, 在土壤調(diào)理劑對(duì)緩解染病砂糖橘的研究中，也發(fā)現(xiàn)SOD表達(dá)量的上升［33］。而本試驗(yàn)3個(gè)組織中毫無另外的都是病原感染導(dǎo)致SOD活性的下降，這可能與取樣時(shí)間有密切關(guān)系，由于黃龍病菌不能夠人工培養(yǎng)，在研究黃龍病菌與長(zhǎng)春花的互作中，經(jīng)常通過人工嫁接染病芽條的方式讓健康長(zhǎng)春花染病，嫁接后到能夠檢測(cè)到病原菌的時(shí)間最快是嫁接后20 d，而在此之前，由于不能確定病原感染是否成功，往往不具備取樣條件，當(dāng)已經(jīng)確定能夠采樣的時(shí)候，病原菌已經(jīng)成功感染，寄主植物已經(jīng)過了應(yīng)激期，基礎(chǔ)代謝受到嚴(yán)重影響。

健康長(zhǎng)春花中POD活性試驗(yàn)周期內(nèi)逐漸增加，其中根中POD的活性較葉和莖中的高，程華等［20］研究銀杏POD基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)POD基因在銀杏的各組織中都有表達(dá), 在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高, 其次為根和果, 而葉部位表達(dá)水平最低。而張麗麗等［34］研究發(fā)現(xiàn)香蕉谷胱甘肽過氧化物酶基因在香蕉的根、球莖、葉片、花和果實(shí)中均有所表達(dá)，其中在花和根中表達(dá)量較高，而在葉片中的表達(dá)量最低。在鹽、澇害、干旱和枯萎病脅迫下MaGPX表達(dá)量升高,說明該基因表達(dá)具有器官差異性和受脅迫的誘導(dǎo)，不同的植物以及不同器官POD的活性變化規(guī)律會(huì)有所不同。分別比較健康和染病植株的葉、莖和根的POD活性發(fā)現(xiàn)，染病植株3個(gè)組織中POD的活性均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。大部分作物的抗性品系中POD的活性也較感病品系的高這與大部分研究結(jié)果一致［35-37］。在黃龍病的研究中，多項(xiàng)研究結(jié)果證明CaLas感染后，柑橘寄主體內(nèi)的POD基因表達(dá)被上調(diào)［14-15］。表明黃龍病菌的感染早期，寄主確實(shí)會(huì)通過提高體內(nèi)POD的活性來增加對(duì)病原菌的抗性。只是病原菌感染的后期由于植株整體衰退，導(dǎo)致所有基礎(chǔ)代謝下降，POD的活性隨之下降。

4 結(jié)論

本研究從防御相關(guān)酶（SOD和POD）活力的變化方面對(duì)長(zhǎng)春花不同組織抵抗黃龍病菌的侵染能力進(jìn)行了探討。在CaLas的脅迫下，長(zhǎng)春花不同的組織，染病不同的時(shí)期，SOD和POD的活性變化表現(xiàn)出不同的規(guī)律，SOD活性隨感染時(shí)間的增加，逐漸下降，葉片中SOD活性最高，莖部又比根部高，POD的活性隨感染時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，根部POD活性總體較葉、莖部高。說明染病不同時(shí)間，長(zhǎng)春花不同部位對(duì)抗CaLas侵染能力和方式也有所不同，葉片和根部分別通過增加SOD和POD活性來抵抗CaLas侵染，而莖部無論是SOD還是POD活性都處于葉、根之間，這一結(jié)果是由植物部位間的結(jié)構(gòu)差異還是各組織抵抗CaLas侵染的機(jī)制不同而導(dǎo)致的，還需要進(jìn)一步深入細(xì)致的研究，以便為柑橘抵御黃龍病菌的侵染機(jī)制及防控研究提供更多、更有價(jià)值的參考。