田雙娥,李思明,趙 晶,廖曉迪

(廣西民族博物館,廣西 南寧 530028)

肉桂為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum Trew)植物,別名玉桂、桂皮、桂枝、筒桂、桂,分布于廣西、廣東、海南、福建、臺灣、云南.肉桂油是從植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥皮、枝、葉中提取得到的揮發(fā)油,為黃色或者棕黃色的澄清液體,有肉桂的特異香氣,味甜,相對密度1.055～1.070,折光率1.602～1.614.[1]其主要化學(xué)成分為肉桂醛.不同提取方法、不同品種、不同樹齡、不同產(chǎn)地的樹皮得油率在0.44%～18.95%之間;葉、枝或枝葉的得油率在0.07%～2.90%之間;根的得油率在0.03%～0.08%之間;果實的得油率在0.72%～2.04%之間.[2]肉桂油具有廣譜的抗菌作用,對細菌、酵母和霉菌均有較強的抑菌活性.[3]

霉菌是絲狀真菌的俗稱,在自然界中以孢子方式繁殖和傳播.空氣中存在大量的孢子,隨著空氣中的顆粒物降沉?xí)皆谖奈锉砻?空氣中溫濕度的波動較大,在溫濕度適宜的條件下,吸附在文物表面的孢子開始萌發(fā),霉菌的生長繁殖意味著文物的劣化開始.賦存于博物館館藏文物展陳環(huán)境中的霉菌孢子的繁殖與博物館中紡織品、紙制品、漆木器、毛皮革等文物的霉變劣化有著密切的關(guān)系.研發(fā)空氣防霉抑菌劑,通過“潔凈”文物展陳環(huán)境,對于博物館展陳文物的微生物病害的預(yù)防具有重要意義.本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了植物源提取物肉桂精油的主要活性成分,并比較了肉桂精油及其主要活性成分肉桂醛對空氣來源的三種霉菌的抑菌效果.旨在為植物源空氣清潔劑在博物館中微生物病害的防治應(yīng)用提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 材料

肉桂精油,購于上海源葉生物科技有限公司,采用水蒸氣蒸餾法獲取.肉桂醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,含量為95%.

三株供試的霉菌菌種分別為霉菌K01,霉菌K02,霉菌K03,均分離純化于廣西民族博物館的展廳空氣中.

主要實驗器皿及用品：容量250 m L的三角錐形瓶、直徑90 mm的培養(yǎng)皿.

霉菌液體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)均為北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器

本研究中所用儀器如表1所示.

表1 儀器名稱Tab.1 The name of the instrument

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油抑菌成分的GC-MS分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對肉桂精油的成分進行分析.

氣相色譜儀條件：毛細管色譜柱HP-35MS 30 m×0.25 mm,0.25μm,載氣為氦氣.

程序升溫：初始柱溫50℃,保持5 min,然后以8℃/min升溫速率升至290℃,保持5 min;進樣口溫度280℃;載氣為高純氦氣,流速1.0 m L/min;進樣量為1 u L,分流比50：1.

質(zhì)譜條件：EI離子源;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍為35～400 amu;離子源300℃,質(zhì)譜接口溫度為250℃.

數(shù)據(jù)庫：采用標準譜庫NIST進行相似度比對.

1.3.2 抑菌活性研究

1.3.2.1 孢子懸液的制備

接種霉菌后的平板放入霉菌培養(yǎng)箱,28℃培養(yǎng)4～6天后將霉菌平板取出,用移液器吸取無菌去離子水輕輕地反復(fù)沖洗平板表面的孢子,將孢子液置于恒溫振蕩器中(200 r/min、28℃)充分振蕩30 min.使用血球計數(shù)板對振蕩后的孢子懸液進行計數(shù),最后使孢子的濃度控制在105～106 CFU/m L范圍內(nèi),并將其置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?孢子懸液使用前保存不超過7天.

1.3.2.2 實驗平板的制備

采用涂布平板法制備試驗平板.將20 m L左右已滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基傾注于無菌的培養(yǎng)皿中,水平靜置待培養(yǎng)基凝固,用移液器吸取0.1 m L孢子懸液后接種于平板,然后用涂布棒涂布均勻.

1.3.2.3 抑菌活性的測定

采用瓊脂平板打孔法.用無菌移液器槍頭(直徑為6 mm)在事先準備的試驗平板上打孔,用無菌尖頭鑷子挑去培養(yǎng)基小塊做成圓孔,并加入瓊脂打底然后往圓孔中滴入10μL肉桂精油或肉桂醛,每個處理分別重復(fù)3次.對照孔則加入等量的無菌水.將平板放置28℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天后測量直徑.

抑菌圈直徑判定肉桂精油及肉桂醛對霉菌的抑菌活性大小.抑菌圈直徑大于20 mm為極敏感,15～20 mm為高度敏感,10～15為中度敏感,6～10 mm為低度敏感;[4]抑菌圈直徑小于6 mm為無抑制作用者,視為不敏感.

1.3.2.4 抑菌圈直徑測量

試驗平板培養(yǎng)好后取出,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑,以直徑(cm)表示抑菌圈的大小.采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05時表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01表示差距具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油的GC-MS化學(xué)成分分析

按照上述1.3.1色譜條件,對肉桂精油進行檢測分析,獲得肉桂精油揮發(fā)性成分的總離子流圖,見圖1.由圖1可知,共分離出46種化合物,經(jīng)質(zhì)譜庫檢索與標準譜圖共同對照分析,共鑒定出40種化合物,占色譜總流出峰相對百分含量的98.749%.各種成分的相對質(zhì)量分數(shù)按峰面積歸一化法計算,結(jié)果見表2.

圖1 肉桂精油GC-MS分析總離子流圖譜Fig.1 The TIC of GC-MS of essential oil from Cinnamom

表2 肉桂精油的化學(xué)成分及其相對含量Tab.2 The chemical components of essential oil from Cinnamom and their relative contents

由表2可知,在GC-MS鑒定的40種化合物中,占比最多的是醛類化合物共7種占總化學(xué)成分的84.147%,酯類化合物5種占6.169%,醇類化合物6種占1.184%,烯類化合物15種占總化合物1.177%,酮類1種占0.026%,其他6種化合物(氧化石竹烯、香豆素、六氫萘、龍腦、氧化肉桂酸、異香橙烯環(huán)氧化物)共占總化學(xué)物的6.046%.相對含量較高的化學(xué)成分有肉桂醛(81.10%)、乙酸肉桂酯(5.954%)、香豆素(5.689%)、苯甲醛(1.246%),共占總化學(xué)成分含量的93.989%.

2.2 真菌對肉桂精油及肉桂醛抗真菌敏感性的研究

采用瓊脂平板打孔法用抑菌圈直徑評價3種受試霉菌對肉桂精油和肉桂醛的抗菌敏感性,抑菌圈直徑統(tǒng)計結(jié)果見表3瓊脂平板抑菌圈實驗結(jié)果照片見圖2.

表3 肉桂精油及肉桂醛對供試菌的抑菌圈直徑Tab.3Antimicrobial activity(inhibition zone)of the tested molds to cinnamon oil and cinnamaldehyde

圖2 肉桂及肉桂醛對供試霉菌抑菌圈照片F(xiàn)ig.2 Photos of inhibition zone test注：A1～A2分別為肉桂和肉桂醛對K01的抑菌圈,B1～B2分別為肉桂和肉桂醛對K02的抑菌圈,C1～C2分別為肉桂和肉桂醛對K03的抑菌圈

由表3知,肉桂精油和肉桂醛對三種受試霉菌的抑菌圈直徑均大于20 mm,抑菌圈直徑與抗菌活性成正比,表明三株霉菌對肉桂及肉桂醛的抑菌活性極度敏感.經(jīng)瓊脂孔平板打孔法抑菌圈實驗比較可知,加入10μL劑量時,肉桂醛對每一種真菌的抑制作用均比肉桂精油的抑菌作用強,可能是肉桂精油中肉桂醛含量(81.100%)較低肉桂醛的緣故.

肉桂醛是一種黃色黏稠狀液體,分子結(jié)構(gòu)為一苯基團連接一個丙烯醛.大量的實驗結(jié)果證明,肉桂醛對真菌、菌絲及毒素和細菌、芽孢都有較好的抑制效果.[5-8]可以廣泛地應(yīng)用于肉制品防腐,罐頭殺菌,水果、蔬菜、牛奶、果汁飲料的保鮮以及新型食品包裝材料等方面.肉桂醛的抑菌機理可通過多方面影響微生物的正常代謝活動起作用,且抑菌作用與肉桂醛的濃度有關(guān),而呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系.[9-10]Shen等人[11]的電鏡掃描結(jié)果直觀地表明,肉桂醛導(dǎo)致細菌外觀形態(tài)發(fā)生明顯變化,對細菌的生長繁殖直接產(chǎn)生抑制作用;而透射電鏡下觀察結(jié)果表明,肉桂醛對微生物的影響不僅在外觀形態(tài),還能對其內(nèi)部細胞質(zhì)產(chǎn)生作用;透射電鏡下觀察結(jié)果還表明,肉桂醛對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的影響表現(xiàn)為使其二者分別發(fā)生細胞解體、裂解、細胞質(zhì)泄露和細胞膜壁分離、細胞溶解、細胞質(zhì)泄露及濃縮.研究表明,相對于細菌而言,肉桂醛對真菌的抑菌能力更強.[12]鄔麗紅等人[13]研究了肉桂醛對煙曲霉菌生物膜的體外作用,結(jié)果表明,肉桂醛對煙曲霉菌具有抗菌活性,亞抑菌濃度的肉桂醛對生物膜具有一定的破壞作用,其中濃度越高作用越強.張赟彬等人[14]對肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行了抑菌殺菌研究,結(jié)果表明,抑殺作用機理可能是因醛基是親水基團,易吸附于細菌或真菌表面的親水基,從而穿入細胞壁破壞其多糖結(jié)構(gòu),最終發(fā)揮抑殺的作用.戴向榮等人[15]的研究報道,肉桂精油首先能使霉菌的細胞壁和細胞膜出現(xiàn)異常,再改變胞內(nèi)的大分子空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致霉菌新陳代謝紊亂,從而抑制霉菌的生長.王丹等人[16]采用體外熏蒸抑菌試驗研究了肉桂精油對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),鏈格孢菌(Alternaria alternata)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)三種主要致病菌的抑制效果,試驗表明,肉桂精油對以上3種優(yōu)勢病原菌均有較好的抑制效果,其最小抑菌濃度(MIC)分別為60μL/L,30μL/L和30μL/L;通過掃描電子顯微鏡可以看出,與對照組相比,經(jīng)肉桂精油處理的3種病原菌菌絲形態(tài)均受到嚴重破壞,發(fā)生凹陷、皺縮、粗糙等一系列變形現(xiàn)象.

中國肉桂油(Cassia oil(Cinnamomum cassia Blume))、肉桂皮油/油樹脂(Cinnanon bark oil/oleoresin(Cinnamomaum spp.))和肉桂醛(Cinnamic aldehyde)均被我國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》列入允許使用的食品天然香料和允許使用的食品用合成香料名單,[17]即在正常的劑量范圍內(nèi)使用肉桂精油和肉桂醛,人類的身體健康不會受到威脅.但用于博物館的文物保護中作為殺蟲抗菌防霉劑時還應(yīng)考慮植物精油及活性提取物對文物本底的安全性,王克華等人[18]的研究表明,不同植物源提取物對紙張及顏料的顏色存在不同影響,香茅醛的熏蒸對紙張及顏料的顏色沒有色差影響,而檸檬醛對紙張基本無色差影響、對顏料色差存在一定程度影響,肉桂醛對顏料的色差存在一定程度的影響、對紙張色差則影響較大.

肉桂油及其活性成分的天然抗菌作用使其廣泛應(yīng)用于食品基質(zhì)中進行殺菌防腐等方面.植物精油來源廣泛,還具有揮發(fā)性高、生物降解性良好、基質(zhì)中殘留低、對環(huán)境友好等優(yōu)點,在文物保護的抑菌防霉殺蟲等生物病害防治工作中備受青睞.國內(nèi)多家博物館單位如上海市博物館、[19]南京博物院、[20]重慶中國三峽博物館[21-22]等進行了植物源提取物防霉抑菌殺蟲等方面的研究.此外,植物精油的復(fù)配能增強抑菌效果并降低各自的使用濃度.汪青青等人[23]利用分級濃度抑制指數(shù)(FIC)評價了肉桂精油和八角精油聯(lián)合使用后的抗菌作用,結(jié)果表明,二者聯(lián)合使用可以增強抗菌效果,降低各自的使用濃度,從而減弱用作保鮮劑時對果蔬感官特性的負面影響.楊柳等人[24]研究肉桂精油、丁香精油及其復(fù)配后的抑菌效果及在香腸中的應(yīng)用,結(jié)果顯示：肉桂精油和丁香精油按1∶1復(fù)配抑菌效果較好,作用時間增長,抑菌效果明顯,添加精油后的香腸與普通香腸比,菌落總數(shù)和p H均較低.以酚類、醛類、醇類、酮類等為抑菌活性物質(zhì)的植物源提取物均有明顯的抗菌活性,在抑菌防霉方面具有開發(fā)潛力.

3 結(jié)論

本文使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測分析肉桂精油,共鑒定出肉桂精油的化學(xué)成分主要40種,相對含量最多的種類是醛類物質(zhì),肉桂醛是肉桂精油的最主要活性物質(zhì).其中相對含量較高的幾種成分依次為肉桂醛含81.1%,乙酸肉桂酯5.954%,香豆素5.689%,苯甲醛1.246%,約占鑒定出化學(xué)成分的93.989%.

肉桂精油是一種天然的抗霉菌劑,對三種供試霉菌的瓊脂平板打孔法抑菌圈實驗結(jié)果表明抑菌圈直徑均遠大于20 mm,肉桂醛是肉桂精油的主要抗菌成分,對霉菌的抗菌效果顯著.經(jīng)比較實驗結(jié)果可知,相同劑量(10μL)的肉桂醛抑菌效力比肉桂精油的強.結(jié)果表明,肉桂精油對霉菌具有顯著的抗菌作用,其主要化學(xué)成分肉桂醛是其主要的抑菌活性成分.肉桂精油及肉桂醛作為植物源提取物應(yīng)用于文物預(yù)防性保護中的霉菌和細菌污染等微生物病害防治中具有良好的發(fā)展前景.