張碩，李卓榮

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

抗菌藥物是人類醫(yī)藥史上最成功的治療藥物，在控制感染性疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。但與此同時，抗生素的濫用及新結(jié)構(gòu)骨架抗生素上市的減少，使細菌耐藥問題變得異常嚴峻。其中最為突出的是鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌。在我國細菌耐藥形勢也是相當嚴峻，2018年11月全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的《2017年全國細菌耐藥監(jiān)測報告(簡要版)》數(shù)據(jù)顯示，2017年全國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥率為56.1%，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥率為20.7%，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯藥物的耐藥率為9.0%，耐藥率較2016年有所上升，大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率為1.5%，甲氧西林耐藥金葡菌全國檢出率為32.2%，萬古霉素耐藥的屎腸球菌檢出率為1.4%，細菌耐藥已嚴重威脅人們的健康。因此開發(fā)針對新靶點的抗菌藥物迫在眉睫。近些年來，氨酰-tRNA合成酶作為抗感染藥物靶標受到的關(guān)注，由葛蘭素史克公司開發(fā)的莫匹羅星(異亮氨酰-tRNA合成酶抑制劑)為第一個針對此類靶點上市的抗感染藥物[1]，2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)又批準了另一個針對亮氨酰-tRNA的抑制劑Tavaborole，用于治療真菌引起的甲癬[2]，證明此類靶點具有開發(fā)研究價值。本文將對氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)、作用機制、分類及近年來針對此類靶點研究狀況進行系統(tǒng)綜述。

1 氨酰-tRNA合成酶

1.1 氨酰-tRNA合成酶結(jié)構(gòu)特點及分類 氨酰-tRNA合成酶廣泛存在于古生菌(archaeal)、細菌和真核細胞中，在細胞生長、保持遺傳編碼正確翻譯方面起到重要作用[3]。目前，在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn) 20多種氨酰-tRNA合成酶(aaRS)，根據(jù)酶催化中心結(jié)構(gòu)(見圖1)不同、亞基組成的差別可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類aaRS的活性中心ATP結(jié)合位點由交替的α-螺旋和β-折疊組成的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，且包含同源保守氨基酸序列HIGH和 KMSKS。HIGH序列位于第一個β-折疊與相連的α-螺旋之間(鏈A與螺旋B),KMSKS序列位于第五個β-折疊后。根據(jù)Ⅰ類酶的序列的相似性，又可分為以下5個亞類，Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe組成，在原核細胞或真核細胞中，每一種亞型的酶具有結(jié)構(gòu)的相似性，可以識別結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，Ⅰa亞型由異亮氨酰-tRNA合成酶、亮氨酰-tRNA合成酶、蛋氨酰-tRNA合成酶和纈氨酰-tRNA合成酶組成，用以識別帶有疏水性基團的氨基酸。Ⅰb亞型由半胱氨酰-tRNA合成酶、谷氨酸-tRNA合成酶和谷酰胺-tRNA合成酶組成，底物氨基酸中帶有電荷。Ⅰc亞型由酪氨酰-tRNA合成酶和色氨酰-tRNA合成酶組成，此類酶可以識別帶有芳香環(huán)的氨基酸底物。由于精氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)與其他I類酶不同為Ⅰd亞型。目前發(fā)現(xiàn)了2種結(jié)構(gòu)類型的賴氨酰-tRNA合成酶，其中一種與Ⅰb亞型結(jié)構(gòu)相似，但含有特殊的α-螺旋結(jié)構(gòu)，列為Ⅰe亞型。

Ⅱ類aaRS的活性中心由7條反平行的β折疊結(jié)構(gòu)和3段同源序列組成。第一段序列中包含由保守的脯氨酸殘基，第二、三段殘基含有保守的精氨酸殘基，與ATP分子結(jié)合有關(guān)[4]。根據(jù)亞結(jié)構(gòu)的不同，其又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc三類。Ⅱa亞型由甘氨酰-tRNA合成酶、組氨酰-tRNA合成酶、脯氨酰-tRNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶和絲氨酰-tRNA合成酶組成，此類亞型的氨酰化反應(yīng)區(qū)域主要位于N-端。Ⅱb亞型由天門冬氨酸-tRNA合成酶、天門冬氨酰-tRNA合成酶、賴氨酰-tRNA合成酶組成，它們在結(jié)構(gòu)上具有相似的C-端氨?；瘏^(qū)域。Ⅱc亞型由丙氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶、苯丙氨酰-tRNA合成酶、吡咯賴氨酰-tRNA合成酶組成。分類見表1。

A.I類酪氨酰-tRNA合成酶(1-222個殘基PDB:3TS1)；B.II 類甘氨酰-tRNA合成酶(α亞單位PDB:3UFG)圖1 氨酰-tRNA合成酶催化中心的結(jié)構(gòu)

雖然在真核細胞或原核細胞中相同亞型的酶存在氨基酸序列的相似性，且具有共同的遺傳祖先，但在相同亞型內(nèi)不同的氨酰-tRNA合成酶，仍具有各自的結(jié)構(gòu)特點，存在著二維及三維的結(jié)構(gòu)差別；另外真核細胞與原核細胞在酶結(jié)構(gòu)、底物識別機制上存在較大的差別，即使在同一物種內(nèi)部，相同的氨酰-tRNA合成酶，由于存在酶遺傳的交叉變異，仍然存在結(jié)構(gòu)上的差別，此為設(shè)計具有選擇性的氨酰-tRNA合成酶抑制劑打下了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1.2 氨酰-tRNA合成酶作用機制 盡管氨基酸的底物不同，所有的氨酰-tRNA合成酶催化過程可分為兩個過程(見圖2)：首先，酶催化氨基酸的羧基和ATP分子中的5′-磷酸基形成共價鍵，形成氨酰-腺苷(aa-AMP)中間體，從而將特定的氨基酸結(jié)合到ATP分子上。第二步，氨酰-tRNA合成酶結(jié)合相應(yīng)的tRNA，氨基酸殘基從aa-AMP轉(zhuǎn)移到tRNA分子末端3′-腺苷酸的2′-OH或3′-OH上，從而形成氨酰-tRNA。然后脫離合成酶，進入核糖體，完成蛋白質(zhì)的合成[5]。

表1 氨酰-tRNA合成酶的分類[4]

圖2 氨酰-tRNA合成酶催化反應(yīng)機理[6]

正確的氨?；磻?yīng)依賴于酶對底物氨基酸與相應(yīng)tRNA分子的識別，酶通過以下的機制保證了tRNA分子與相應(yīng)的氨基酸發(fā)生?；磻?yīng)，首先酶具有特殊的反應(yīng)位點，用以識別和活化特定的氨基酸，體積較大的氨基酸不能進入酶的反應(yīng)位點。另外tRNA分子較大，具有較多的特征元素，相對于小分子，酶發(fā)生錯配的概率更低。另外酶還存在編輯位點以水解錯配的氨基酸。Martinis等[7]報道可分為以下兩種機制，1是轉(zhuǎn)錄前的編輯，酶可將錯誤?；陌滨?腺苷水解為氨基酸和AMP分子。2是轉(zhuǎn)錄后的編輯，酶可將錯誤?；膖RNA分子水解。酶存在的特殊的催化位點及編輯位點將氨基酸錯配的概率降低到4萬分之1[8]。

2 已上市及處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

針對此類靶點的抑制劑，目前已有3種藥物批準上市，另外還有藥物處于臨床階段，說明此類蛋白可成為藥物靶點，具有深入的開發(fā)研究價值，首先介紹已上市及處于臨床階段的化合物。

2.1 莫匹羅星 莫匹羅星[1](見圖3，化合物3)是被FDA批準上市的第一個針對異亮氨酰-tRNA合成酶(Ile-RS)的抑制劑，通過局部給藥，用于治療由金葡菌引起的皮膚感染及預(yù)防金葡菌引起的鼻腔帶菌。它是從熒光假單胞菌中分離得到的天然產(chǎn)物，通過競爭異亮氨酸結(jié)合位點，從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，其對大腸桿菌異亮氨酰-tRNA合成酶的親和力達到2.5 nmol·L-1。另外，此化合物還表現(xiàn)出了較好的選擇性，其對細菌的蛋白親和力是人蛋白親和力的8 000倍[9]。莫匹羅星主要針對革蘭陽性菌，對甲氧西林耐藥的金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)值為0.25～0.5 μg·mL-1。

2.2 Tavaborole 2014年FDA批準了Anacor制藥公司開發(fā)的針對亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)編輯位點的抑制劑藥物Tavaborole(曾用名AN2690，見圖3，化合物4)，屬于硼化合物[2-3]。通過局部給藥用于治療真菌引起的甲癬，其對紅色毛癬菌、須毛癬菌MIC值為1 μg·mL-1，對白色念珠菌的MIC值為0.5 μg·mL-1 [10]。AN2690通過與tRNALeu3′-腺苷的2′和3′氧原子共價結(jié)合于LeuRS的編輯位點，通過阻礙酶結(jié)構(gòu)的翻轉(zhuǎn)起到抑制蛋白質(zhì)合成的作用，從而產(chǎn)生抗真菌作用[3]。

2.3 常山堿衍生物HF HF(見圖3，化合物5)屬于鹵代的常山堿類(從常山植物中分離得到植物堿)衍生物，在許多方面表現(xiàn)出了生物活性，包括抗瘧疾、腫瘤、纖維化和自身免疫等方面。其可通過抑制脯氨酰-tRNA合成酶而起到抗瘧及抗寄生蟲作用，1999年被歐盟批準用于獸用治療球蟲病[11]，另外研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制Th17細胞分化從而起到抑制炎癥及對抗自身免疫方面的活性，在2000年被FDA批準為孤兒藥用于治療與免疫系統(tǒng)相關(guān)的硬皮病[12]。

2.4 REP8839 REP8839 (見圖3，化合物6)為蛋氨酰-tRNA合成酶抑制劑，其對金葡菌的蛋氨酰-tRNA合成酶(MetRS)的親和力達到10 pmol·L-1。主要針對金葡菌引起的皮膚和傷口感染，其對莫匹羅星耐藥的金葡菌的MIC90值為0.5 μg·mL-1，對25株臨床分離的表葡菌的MIC90值為0.12 μg·mL-1，另外對48株分離的釀膿鏈球菌MIC90值為0.12～0.25 μg·mL-1，而莫匹羅星對其中耐藥菌株MIC90值為8 μg·mL-1 [13]，其主要對抗皮膚感染的金葡菌與釀膿鏈球菌，另外不僅對甲氧西林、莫匹羅星耐藥的金葡菌，對萬古霉素中介及耐藥的菌株也表現(xiàn)較好活性，目前正處于臨床Ⅰ期。

圖3 已上市或處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 氨酰-tRNA合成酶抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)方式

除上述介紹的幾種已上市或處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑外，人們也在不斷發(fā)現(xiàn)針對此類靶點的新化合物，大體可分成3種途徑：①通過微生物發(fā)酵，天然產(chǎn)物修飾策略發(fā)現(xiàn)了一批具有抗菌活性的化合物，包括莫匹羅星，通過對天然產(chǎn)物進行全細胞篩選，確定了許多針對氨酰-tRNA合成酶的抑制劑具有抗菌活性；②通過模擬酶底物方式發(fā)現(xiàn)高親和力化合物；③通過酶活及計算機輔助設(shè)計手段得到親和力骨架，然后進行結(jié)構(gòu)改造，已發(fā)現(xiàn)新骨架的抗菌化合物。以下分別介紹上述3種策略的研究情況。

3.1 微生物發(fā)酵、天然產(chǎn)物修飾途徑

3.1.1 莫匹羅星及結(jié)構(gòu)類似物 1971年，F(xiàn)uller等[14]報道了從熒光假單胞菌的代謝產(chǎn)物中分離得到了假單胞菌酸A，即莫匹羅星。作為已上市的抗菌藥物，目前關(guān)于莫匹羅星耐藥的金葡菌也已報道，可分為高耐藥(MIC>512 μg·mL-1)，基于菌體產(chǎn)生mupA基因，從而獲得第二種異亮氨酰-tRNA合成酶引起[15]，及中度耐藥(MIC為4～512 μg·mL-1)，由異亮氨酰-tRNA合成酶的點突變引起[16]，與此同時，關(guān)于莫匹羅星的結(jié)構(gòu)改造也在繼續(xù)，結(jié)構(gòu)中的α、β不飽和酯結(jié)構(gòu)影響了系統(tǒng)給藥的代謝穩(wěn)定性，酯基水解后抗菌活性消失，Brown等[17]根據(jù)生物電子等排體將α、β不飽和酯替換為不飽和的五元芳環(huán)，其中化合物7、8 (見圖4)的MIC值為2～8 μg·mL-1，不如莫匹羅星。Broom等[18]在惡唑環(huán)的基礎(chǔ)上連上帶硝基的芳環(huán)結(jié)構(gòu)，提高了莫匹羅星的活性并拓展了抗菌譜，化合物9、10(見圖4)對莫匹羅星耐藥的脆弱擬桿菌、金葡菌C37和F89表現(xiàn)出了一定活性。對莫匹羅星耐藥金葡菌表現(xiàn)出活性反映其作用機制并非僅通過抑制細菌的異亮氨酰-tRNA合成酶發(fā)揮抗菌作用，進一步機理研究顯示，該硝基化合物通過細菌的NADH和NADPH-依賴的還原酶轉(zhuǎn)變成活性產(chǎn)物而進一步起到抑菌作用。

圖4 莫匹羅星結(jié)構(gòu)改造物

3.1.2 疏螺體素(BN) 疏螺體素 (見圖5，化合物11)屬于蘇氨酰-tRNA合成酶抑制劑，1949年Berger等[19]在鏈霉菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，它能強有力的抑制細菌和真核細胞的ThrRS。BN具有十八元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，可通過誘導(dǎo)契合的機制結(jié)合于與ThrRS的中心活化位點的關(guān)鍵區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)其可占據(jù)蘇氨酰-tRNA合成酶部分氨基酸位點、ATP、tRNA及輔助位點，從而起到抑制ThrRS的作用，此化合物具有強的抗瘧活性，半抑制濃度(IC50)值達到0.97 nmol·L-1，其活性與臨床使用的青蒿素甲醚、氯喹相似[20]。

3.1.3 吲哚霉素 吲哚霉素(見圖5，化合物12)是1960年Marsh等[21]首次報道的從白色鏈霉菌中分離得到的一種抗生素。其結(jié)構(gòu)中含有色氨酸結(jié)構(gòu)，提示通過細菌的芳香氨基酸攝入系統(tǒng)進入細胞內(nèi)，競爭結(jié)合色氨酰-tRNA合成酶(Trp-RS)而起到抗菌作用。吲哚霉素對革蘭陽性菌和少數(shù)革蘭陰性菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其對32株甲氧西林敏感的金葡菌的MIC值為0.125～0.5 μg·mL-1，對28株甲氧西林耐藥的金葡菌的MIC值為(0.125～2 μg·mL-1)，對7株萬古霉素中介的金葡菌的MIC值為(0.125～2 μg·mL-1)，對莫匹羅星和夫西地酸耐藥的金葡菌也表現(xiàn)出較好的抑菌活性[22]。此外，研究發(fā)現(xiàn)吲哚霉素還具有良好的抑制幽門螺桿菌的活性[23]。目前，有報道在灰色鏈霉菌上發(fā)現(xiàn)了由于TrpRS上的 (H43N)點突變引起的耐藥性。在吲哚霉素的改造方面，Witty 等[24]在將6位的甲基變?yōu)橐一?、甲硝基及羧酸酯基后活性大幅度下降，?位引入羥基活性可以保持。

3.1.4 創(chuàng)新霉素 創(chuàng)新霉素(見圖5，化合物13)是我國科研工作者于1976年首先在濟南放線菌3945中發(fā)現(xiàn)的全新結(jié)構(gòu)的抗生素[25]，經(jīng)驗證其屬于色氨酰-tRNA合成酶抑制劑，具有中等抗菌活性[26]，其主要對革蘭陽性菌和少數(shù)革蘭陰性菌具有抑制作用，對金色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及流行性感冒桿菌具有抗菌作用。其對金色葡萄球菌的MIC值為1.56～3.125 μg·mL-1，對大腸桿菌1515的MIC值為3.125～6.25 μg·mL-1。在結(jié)構(gòu)改造方面，蘇盛惠等[25]合成若干羧酸衍生物，包括酯及酰胺結(jié)構(gòu)，另外對吲哚環(huán)上氮上進行取代衍生化，衍生物的體外抗菌活性表明，除N-甲酰基取代衍生物與創(chuàng)新霉素活性相當外，其他衍生物均無明顯的抗菌活性。戚天慶等合成了去硫創(chuàng)新霉素，發(fā)現(xiàn)其也是通過抑制Trp-RS起到抗菌作用，其對E.coliB的抗菌活性與創(chuàng)新霉素相當[27]。Brown等[28]對創(chuàng)新霉素新行了開環(huán)，擴環(huán)以及羧基上的修飾得到一個對金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和卡塔莫拉菌活性較好的內(nèi)酯化合物。

3.1.5 Microcin C 1976年Asensio等[29]首先報道了Microncins為來源于大腸桿菌的具有抗菌活性的可透析的抗菌物質(zhì)。Garcia-Bustos 等[30]首次確定了其中活性成分Microncin C (見圖5，化合物14)分子中包含有7肽結(jié)構(gòu)，對部分革蘭陰性菌表現(xiàn)出了一定的抑菌活性，包括沙門氏屬、克雷伯屬、埃希氏菌屬等。研究發(fā)現(xiàn)此化合物利用7肽鏈的木馬策略，通過敏感菌株的YejABEF基因編碼的內(nèi)膜ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入細胞內(nèi)，在氨肽酶的作用下分解為天門冬氨酰-腺苷類似物，起到抑制天門冬氨酰-tRNA合成酶的作用。Vondenhoff等[31]利用Microncin C的攝入機制，改變肽鏈上第7位氨基酸，開發(fā)了合成Microncin C 類似物的方法，并研究了此類化合物的轉(zhuǎn)運機制，發(fā)現(xiàn)7位氨基酸對轉(zhuǎn)運蛋白的識別具有重要影響，其中極性氨基酸如天門冬氨酸、賴氨酸時活性優(yōu)于非極性氨基酸，另外7位為甘氨酸也表現(xiàn)出活性。此類似物的合成方法，為利用木馬策略改善化合物的攝入提供了借鑒。

3.1.6 白霉素 白霉素 (見圖5，化合物15) 是1947年Reynolds等[32]報道的從鏈霉菌屬中發(fā)酵分離得到的抗生素，目前已發(fā)現(xiàn)了3種成分δ1、δ2、ε[33]，為另一個通過木馬策略進入細菌的氨酰-tRNA合成酶抑制劑，其通過連接的異羥肟酸鐵載體進入細菌內(nèi)部，水解釋放出由硫取代的呋喃糖的腺苷類似物，研究發(fā)現(xiàn)其對蘇氨酰-tRNA合成酶的抑制活性達到8 nmol·L-1。Paulsen等[34]研究發(fā)現(xiàn)其硫取代的糖的結(jié)構(gòu)對活性至關(guān)重要，將其改為氧取代后活性消失。2018年Lin等[35]首次報道了白霉素的全合成，其中白霉素δ2對臨床分離的肺炎鏈球菌的MIC值達到10 ng·mL-1，對臨床分離金葡菌的MIC值為小于0.25 μg·mL-1。另外對大腸桿菌ATCC 25922 MIC值也達到0.25 μg·mL-1。

3.1.7 Ascamycin Ascamycin(見圖5，化合物16)是由鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的核苷類抗生素，1984年Isono等[36]首次報道了Ascamycin的分離及結(jié)構(gòu)。Ascamycin分子中含有2-氯腺嘌呤結(jié)構(gòu)，屬于氨酰-腺苷類似物，研究發(fā)現(xiàn)其可選擇性的抑制百葉枯病菌和柑橘潰瘍病菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶，而對大腸桿菌沒有表現(xiàn)出活性。然而去丙氨酰Ascamycin除對上述兩株菌具有抗菌活性外，對部分革蘭陰性菌和陽性菌均表現(xiàn)出一定的活性，分析脫去丙胺酰基后，化合物能更好地透過細菌外膜從而表現(xiàn)出更廣的抗菌譜[37]。

圖5 微生物發(fā)酵來源的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

3.2 氨酰-tRNA合成酶底物類似物 近些年來，通過模擬底物的方式進行氨酰-tRNA合成酶抑制劑的設(shè)計與發(fā)現(xiàn)也取得一定進展。酶底物氨基酸或中間體氨酰-腺苷類似物，由于結(jié)構(gòu)相似性，可競爭性結(jié)合相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶，從而表現(xiàn)出酶抑制及抗菌活性。由此許多非天然氨基酸及類似物，及氨酰-腺苷類似物成為潛在具有抗菌作用的化合物。

3.2.1 氨基酸類似物

3.2.1.1 呋喃霉素 呋喃霉素(見圖6，化合物17)屬于非天然的α氨基酸，1967年Katagiri等[38]報道其可競爭性的結(jié)合異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)，從而具有抑制細菌生長的作用，在化學(xué)合成培養(yǎng)基條件下對副痢疾志賀菌、副傷寒沙門菌的MIC值為2～5 μg·mL-1，對枯草桿菌PCI219的MIC值為1 μg·mL-1，但在營養(yǎng)瓊脂中測定卻未表現(xiàn)出抗菌活性。

3.2.1.2 順戊霉素 1989年Konishi等[39]報道了順戊霉素(見圖6，化合物18)為從蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中分離得到具有抗真菌活性的化合物，其結(jié)構(gòu)為(1R,2S)-2-氨基環(huán)戊烷-1-羧酸，結(jié)構(gòu)與脯氨酸類似，其可競爭性的結(jié)合脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)，從而起到抑菌作用，具有較好的抑制真菌的作用，其對臨床分離的白色念珠菌的IC50及IC100濃度分別為6.3～12.5 μg·mL-1及6.3～50 μg·mL-1 [39-40]。

3.2.1.3 艾芬凈噴 自從天然發(fā)酵產(chǎn)物順戊霉素被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性以后，德國的拜耳公司展開了對合成的環(huán)狀的β-氨基酸衍生物抗真菌活性的研究[41]，其中艾芬凈噴(見圖6，化合物19)為抗菌活性最好的化合物，為抗真菌的異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)抑制劑，其為特殊的β-氨基酸結(jié)構(gòu)，1R,2S構(gòu)型對其活性至關(guān)重要，其可通過特殊的支鏈氨基酸的滲透酶主動轉(zhuǎn)運至白色念珠菌內(nèi)，濃度可提高200倍，在菌體內(nèi)通過抑制異亮氨酰-tRNA合成酶起到抑菌活性，對白色念珠菌BSMY212的MIC90值為2 μg·mL-1 [42]。

一些氨基酸類似物也具有抗生素的作用，例如硫代異亮氨酸(見圖6，化合物20)、O-甲基蘇氨酸(見圖6，化合物21)，刀豆氨酸(見圖6，化合物22)等，一方面通過競爭性的與氨酰-tRNA的結(jié)合，從而抑制正常蛋白質(zhì)的合成，起到抑菌作用。另一方面由于它們被誤合成入肽鏈，導(dǎo)致蛋白活性的減弱或消失[43]。

圖6 模擬氨基酸底物的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

3.2.2 氨酰-腺苷類似物 研究發(fā)現(xiàn)氨酰-腺苷中間體對酶的親和力可達到nmol級，高于底物氨基酸和ATP2-3個數(shù)量級[44]，因此通過基于活性中間體氨酰-腺苷(aa-AMP)結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計，成了開發(fā)此靶點抑制劑的研究熱點。

由于活性中間體氨酰-腺苷具有高能量的酰基-磷酸酯鍵，此類結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，許多天然來源的aaRS抑制劑也將不穩(wěn)定的?；?磷酸酯linker替換成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，如Microcin C和Agrocin 84(見圖7，化合物23)將?；?磷酸酯(見圖7，化合物24)替換為氨酰-磷酸酯，Ascamycin將?；?磷酸酯替換為氨酰-磺酸酯鍵。

通過理性設(shè)計改造aa-AMP類似物，集中于提高此類化合物的化學(xué)穩(wěn)定性、與靶蛋白的親和力、體內(nèi)的親和力及選擇性。目前許多研究已將aa-AMP分子中不穩(wěn)定的酰基-磷酸酯鍵通過生物電子等排體替換為穩(wěn)定的基團，如Bernier等[45]通過谷氨酰胺還原，然后與腺苷反應(yīng)得到linker為氨烷基-磷酸酯的化合物，評價其對大腸桿菌谷氨酰胺-tRNA合成酶(GlnRS)的抑制劑活性，發(fā)現(xiàn)此化合物對谷氨酰胺的抑制常數(shù)為280 nmol·L-1。

Forrest等[46]合成了linker分別為氨烷基-磷酸酯(見圖7，化合物25)和氨酰-磺酸酯的精氨酸、組氨酸和蘇氨酸的腺苷類似物，并評價其對金葡菌相應(yīng)氨酰-tRNA合成酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)兩類linker的腺苷類似物對I類酶精氨酰-tRNA的IC50值達到7.5 nmol·L-1和4.5 nmol·L-1，對II類酶的活性氨酰-磺酸酯類優(yōu)于氨烷基-磷酸酯。

Lee等[47]研究了腺苷與氨基酸間的linker為酯基(見圖7，化合物26)和異羥肟酸基(見圖7，化合物27)的氨酰-腺苷類似物對大腸桿菌蛋氨酰-tRNA合成酶與異亮氨酰-tRNA合成酶親和力的影響，酯基linker對蛋氨酰-tRNA的IC50為3.6 μmol·L-1，優(yōu)于對異亮氨酰-tRNA合成酶的親和力。

此外linker結(jié)構(gòu)分別為酰胺鍵[48](見圖7，化合物28)、磺酰胺[49](見圖7，化合物29)、氨基磺酸酯[50](見圖7，化合物30)、N-羥基磺酰胺[51](見圖7，化合物31) 、羥肟[47，52]等也相繼被報道。

圖7 氨酰-腺苷類似物結(jié)構(gòu)

Brown等[50]建立了莫匹羅星與Ile-RS相互作用模型，通過研究發(fā)現(xiàn)氨基酸與糖linker的長短對蛋白的結(jié)合具有決定性的影響，改變linker的長度會明顯降低親和力；另外將連接的氧原子被亞甲基或氮原子取代也會影響負電荷密度從而大幅度降低親和力。

2015年Gadakh等[44]通過改變腺苷與氨基酸linker的連接方式，省去了與糖連接的氧原子，將氨酰-磷酸酯變?yōu)榘滨?磺胺結(jié)構(gòu)，提高了化合物的穩(wěn)定性。其中化合物32 (見圖8) 對大腸桿菌表現(xiàn)出一定的抑制活性，說明此類化合物可以透過細菌外膜，但由于氧原子省去，減少了與酶的相互作用，降低了親和力。

此類氨酰-磺胺類結(jié)構(gòu)被證明是對氨酰-tRNA合成酶有效的骨架，但因體內(nèi)缺乏選擇性而影響了此類化合物的應(yīng)用。另外，由于此類結(jié)構(gòu)化合物中腺苷3位的N容易與糖的5′位發(fā)生親核反應(yīng)，影響了此類結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及后續(xù)開發(fā)研究。

2018年Zhang等[53]報道保留腺苷與氨基酸linker的氨基磺酸酯結(jié)構(gòu)，改變堿基的母核結(jié)構(gòu)，將堿基改為3位脫去氮原子的腺苷，避免了腺苷3位N的親核副反應(yīng)的發(fā)生，通過連接不同的氨基酸合成了一系列化合物33 (見圖8) 對Ⅰ類和Ⅱ類的aaRS表現(xiàn)出不同的抑制活性，對Ⅰ類酶的親和力明顯優(yōu)于Ⅱ 類酶。但此類化合物的抗菌活性并不理想。

圖8 氨酰-腺苷類似物改造物結(jié)構(gòu)式

雖然此類化合物在體外表現(xiàn)出了較好的酶抑制活性，但其抗菌活性往往不佳，可能是由于化合物透細菌外膜不佳引起。如何提高化合物的攝入，Microcin C和白霉素的木馬策略為此類化合物的進一步改造提供了借鑒。另外此類結(jié)構(gòu)對哺乳動物細胞與病原菌的選擇性也是開發(fā)研究需要考慮的問題。

3.3 酶活或計算機輔助設(shè)計方式 通過酶活或計算機輔助設(shè)計得到針對此類靶點的苗頭化合物，然后進行結(jié)構(gòu)修飾得到抗菌活性的化合物也是一種研究開發(fā)策略。

2002年Jarvest等[54]報道，通過對酶活篩選得到了針對金葡菌蛋氨酰-tRNA合成酶(MetRS)抑制劑，其具有喹諾酮母核結(jié)構(gòu)，但其對金葡菌未表現(xiàn)出抗菌活性，通過對苗頭化合物的改造，得到了由喹諾酮通過丙二胺linker連接四氫喹啉結(jié)構(gòu)化合物，化合物34、35(見圖9)對酶的IC50值小于20 nmol·L-1，其中化合物34對31株金葡菌的MIC90值為0.5 μg·mL-1，另外對10株腸球菌的MIC90值為0.03 μg·mL-1，化合物35對金葡菌感染鼠腹股溝膿瘡感染模型實驗中，也表現(xiàn)了較好的抑菌活性，其靜脈注射21 mg·kg-1給藥劑量與靜脈注射50 mg·kg-1的紅霉素效果相當。

2004年Beyer等[55]報道了苯基-噻唑脲-磺胺類化合物36(見圖9)對來自大腸桿菌、流感嗜血桿菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶(phe-RS)的IC50值達到nmol水平，此外還具有良好的細菌和哺乳細胞選擇性。其體外抗菌活性表現(xiàn)出了一定的苯丙氨酸依賴性，對缺乏苯丙氨酸的S.aureus、H.influenzae的MIC值為0.4 μg·mL-1；S.pneumoniae的MIC值為0.8 μg·mL-1。且肺炎雙球菌的依賴性低于金葡菌，在S.pneumoniae感染的大鼠敗血癥模型的體內(nèi)試驗中，化合物36表現(xiàn)出了較好的抑菌效果。在注射給藥100 mg·kg-1于S.pneumoniae感染的大鼠，在感染后0.5～3 h，肺、腎臟、脾臟的CFU下降2至3 log10單位。

2013年Teng 等[56]報道了基于結(jié)構(gòu)設(shè)計的選擇性細菌蘇氨酰-tRNA合成酶抑制劑。以化合物與酶的共晶結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)，用氨基喹啉環(huán)連苯結(jié)構(gòu)替代腺苷結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)能較好誘導(dǎo)酶的關(guān)閉構(gòu)型。且與ser517缺乏氫鍵作用的化合物具有較好的原核細胞與真核細胞選擇性?；衔锏幕钚暂^先導(dǎo)物有較大的提高，其中化合物37(見圖9)對流感嗜血桿菌的MIC為4 μg·mL-1，且對于外排泵敲除的大腸桿菌也表現(xiàn)出一定的活性。

呋喃酮類結(jié)構(gòu)存在于許多天然產(chǎn)物及合成中，其中許多顯示出抗氧化、抗炎癥反應(yīng)等活性，2011年Xiao等[57]報道了具有3-芳基-4-烷基胺呋喃酮結(jié)構(gòu)的化合物對金葡菌ATCC25923、枯草桿菌ATCC6633及白色念珠菌ATCC10231具有一定的抑菌活性，其中化合物38(見圖9)，對金葡菌的MIC50值為0.42 μg·mL-1，優(yōu)于卡那霉素，通過酶活驗證其對酪氨酰-tRNA合成酶具有較強的抑制作用，其IC50值為(0.12± 0.04)μmol·L-1。同年，Xiao等[58]又報道了3-芳基-4-芳氨基呋喃酮類化合物作為酪氨酰-tRNA合成酶抑制劑表現(xiàn)了一定的抑菌活性，化合物39(見圖9)對金葡菌ATCC25923的MIC50值為0.06 μg·mL-1，對枯草桿菌ATCC6633的MIC50值為1.2 μg·mL-1。2013年Wang等[59]通過改變4位芳基與呋喃酮的linker，使呋喃酮類衍生物對部分革蘭陰性菌表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中化合物40(見圖9)對綠膿桿菌ATCC27853的MIC50值為1.5 μg·mL-1，大腸桿菌ATCC35218的MIC50值為4.3 μg·mL-1。分子對接驗證此類化合物與細菌酪氨酰-tRNA合成酶具有很好結(jié)合。

2014年Sun等[60]報道了(萘亞甲基)噻吩酮類化合物，通過篩選其對金葡菌酪氨酰-tRNA合成酶的抑制活性，得到了IC50<20 μmol·L-1的化合物，通過篩選其對金葡菌ATCC25923、枯草桿菌ATCC6633及陰性菌銅綠假單胞ATCC13525，大腸桿菌ATCC 35218的活性，發(fā)現(xiàn)化合物41(見圖9)對金葡菌具有較好的抑菌活性，MIC50值為0.21 μg·mL-1，對枯草桿菌的MIC50值為3.66 μg·mL-1，對革蘭陰性菌未表現(xiàn)出抑菌活性。分子對接顯示其與酪氨酰-tRNA合成酶具有很好結(jié)合，并提示在苯環(huán)上引入親水性取代基可進一步提高親和力。

圖9 通過酶活篩選或計算機輔助設(shè)計得到的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

4 結(jié)論

面對日益嚴峻的細菌耐藥問題，臨床迫切期望開發(fā)新靶點的抗菌藥物，隨著莫匹羅星及Tavaborole等的上市，證明氨酰-tRNA合成酶可作為抗感染藥物的靶標。許多微生物發(fā)酵產(chǎn)物證明可通過抑制氨酰-tRNA合成酶而起到抗菌作用，為進一步的藥物開發(fā)提供了結(jié)構(gòu)豐富的化合物寶庫。日益興起的計算機虛擬篩選技術(shù)，為得到新的結(jié)構(gòu)片段及理性設(shè)計提供了有力工具，提高了獲得針對此類靶點新骨架化合物的效率。如何進一步提高天然發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性，拓展抗菌譜；另外提高酶底物類似物的透膜性質(zhì)及選擇性；利用好虛擬篩選、計算機輔助設(shè)計等手段，指導(dǎo)活性片段發(fā)展為新骨架的抗感染藥物，成為針對此靶點進一步研究開發(fā)的挑戰(zhàn)。相信隨著對原核生物氨酰-tRNA合成酶晶體結(jié)構(gòu)功能研究的深入，新的研發(fā)技術(shù)和工具的應(yīng)用，會有更多的針對此類靶點的抗感染藥物上市。