王沖，林春雨，吳志強，李明玉

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門 361102)

隨著天然藥物相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的天然藥物被人們所發(fā)現(xiàn)，由此帶來的對其活性進行篩選的需求也隨之增加。傳統(tǒng)意義上的藥物篩選，通常是基于分子靶點和細(xì)胞表型分析進行的藥物篩選[1]。但是這種體外篩選的方式并不能直接反應(yīng)藥物在體內(nèi)的作用效果。近年來，隨著藥物篩選的發(fā)展，越來越多的以小型動物，如：秀麗線蟲、果蠅、斑馬魚、非洲爪蟾為模型進行體內(nèi)藥物篩選的方式正快速發(fā)展[2-3]。這種將藥物直接作用于個體水平的篩選方式，不僅能夠直接反應(yīng)出藥物對生物體的毒性影響，而且能夠更加全面地反應(yīng)出藥物對整個生物體的影響[4-6]。由于斑馬魚具有眾多適合藥物篩選應(yīng)用的優(yōu)點，如：胚胎透明、便于觀察；繁殖率高、成本較低；體型較小、便于操作等。因此，以斑馬魚為模型進行藥物篩選正得到越來越廣泛的應(yīng)用[6-7]。

本文利用斑馬魚的這一特點，以斑馬魚為模型進行黃酮類化合物的藥物篩選。黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物，廣泛分布于各種植物組織中，如：荷葉、蒲公英、金銀花葉、橘皮、竹葉等[8]。在植物體內(nèi)，黃酮類化合物通常與糖類結(jié)合形成苷類化合物。據(jù)報道，黃酮類具有多種醫(yī)藥學(xué)功能，如降壓、降糖、降血脂、抗氧化等[9-12]，但具體的機理尚不清楚。

本文主要探究黃酮類藥物的降糖功效與胰腺β細(xì)胞數(shù)量之間的相互關(guān)系。糖尿病以1型和2型為主，1型糖尿病是自體免疫性疾病，由自體免疫系統(tǒng)破壞產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞引起的[13]。2型糖尿病主要由胰島素抵抗及胰島素相對缺乏引起的[14]。這兩種糖尿病的最終發(fā)病都會引起胰島β-細(xì)胞數(shù)量減少或者功能損傷，從而降低胰島素的分泌[15]。而尋找促進胰島β-細(xì)胞增生的藥物，以期用在糖尿病治療上一直是科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[16]。本文采用β-細(xì)胞特異性表達mCherry的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-1.2ins:H2BmCherry)為模型，進行黃酮類化合物促β-細(xì)胞增生的活性篩選。并通過指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)][17]，以及指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)[18]進行進一步分析。整個篩選操作簡單，方法便捷高效，可為黃酮類藥物在糖尿病領(lǐng)域的進一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器、實驗試劑以及實驗動物

1.1 儀器 電子天平(舜宇恒平儀器)；體式熒光顯微鏡Leica M165FC(萊卡公司)；正置熒光顯微鏡AXIO IMAGER AI (蔡司公司)；共聚焦顯微鏡Zeiss LSM5(蔡司公司)。

1.2 實驗試劑 二甲基亞砜(DMSO，生工，批號：D807BA001)；潑尼松龍(MCE ，批號：50-24-8)；磷酸緩沖液(10X PBS，BBI 生命科技，批號：EB12FA0001)； 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Thermo fisher，批號：15630080)； 多聚甲醛(PFA，生工，批號：D606BA0003)； 間氨基苯甲酸乙酯(Sigma公司，批號：MKBX0252V)； 黃酮類藥物(成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)； Amplex Red 試劑盒 (Invitrogen A12222)。

1.3 實驗動物 野生型斑馬魚(AB); Tg(-1.2ins:H2BmCherry)轉(zhuǎn)基因斑馬魚; TgBAC(neurod:eGFP) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚; Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

2 實驗方法

2.1 實驗動物-斑馬魚的養(yǎng)殖以及魚卵的收集培養(yǎng)

2.1.1 斑馬魚的飼養(yǎng) 斑馬魚的飼養(yǎng)是按照標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)方法：每天3次投喂顆粒飼料，早晚各喂養(yǎng)一次豐年蟲卵，并給予適宜的光照(光照∶黑暗=14∶10)和溫度(25 ℃)，并利用堿泵和鹽泵調(diào)節(jié)適宜的pH(pH為7左右)和電導(dǎo)率(電導(dǎo)率為500左右)進行培養(yǎng)。

2.2.2 魚卵的收集及培養(yǎng) 在夜間避光環(huán)境下將一雌一雄的斑馬魚共同放置在同一配魚缸里，第二天白天光照的刺激下，收集沉落在配魚缸缸底的受精卵。將其放置在魚卵培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，培養(yǎng)箱中的溫度維持在28.5 ℃，光照∶黑暗的時間比為14∶10。在培養(yǎng)期間，每天都應(yīng)更換新鮮的斑馬魚水溶液，以維持斑馬魚生活環(huán)境的清潔。

2.2 斑馬魚的藥物處理 轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(-1.2ins:H2BmCherry)、Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]、TgBAC(neurod:eGFP)產(chǎn)生的胚胎發(fā)育至第5天，轉(zhuǎn)移至24孔板中，將每一孔中加入2 mL的斑馬魚水溶液、10條魚和2 μL的藥物(終濃度為10 μmol·L-1),并處理24 h。藥物處理時，以 DMSO為空白對照組，以潑尼松龍(Prednisolone，10 μmol·L-1)為陽性對照組。

2.3 斑馬魚的固定、胰島β細(xì)胞的成像和計數(shù) 藥物處理過斑馬魚胚胎用4% PFA進行過夜固定。固定好的斑馬魚胚胎，轉(zhuǎn)移至載玻片上，并使右側(cè)朝上，在其上面滴加適量封片劑進行封片。封片完畢后，利用斑馬魚自身的胰島β細(xì)胞所帶有的熒光蛋白進行共聚焦顯微成像和細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計。

2.4 斑馬魚血糖含量的測定 利用Amplex Red 試劑盒測定斑馬魚幼魚的葡萄糖含量。每10條魚勻漿于100 μL的緩沖液中，然后利用離心的方法清除勻漿。按照試劑盒的要求，每10 μL的上層清液就等同于一條幼魚，對每條魚的血糖進行測量。室溫下孵育30 min。然后通過酶標(biāo)儀測量其熒光值，設(shè)置的波長分別為：激發(fā)光：520 nm，發(fā)射光：580～640 nm。藥物處理時，以 DMSO為空白對照組，以羅格列酮(RGZ,10 μmol·L-1)為陽性對照組。每一組應(yīng)做3個重復(fù)。

3 實驗結(jié)果

3.1 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞的增生作用分析 我們選取了11種不同的黃酮類化合物，包括脫水淫羊藿素、淫羊藿素、香葉木素、柳穿魚黃素、高黃芩素(野黃芩素)、甘草查爾酮C、芫花素、羥基芫花素、穗花杉雙黃酮、洋艾素和銀杏雙黃酮。利用Tg(-1.2ins:H2BmCherry)斑馬魚胚胎，對這些化合物進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組的β細(xì)胞為(32.67±1.922)，潑尼松龍作為陽性藥物，也能夠增加β細(xì)胞的數(shù)量。而黃酮類化合物中，柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮與空白對照DMSO相比，能夠增加紅色胰島β細(xì)胞的數(shù)量，分別為(37.60±1.951)、(37.53±1.786)、(45.00±2.714)、(33.77 ±2.612)和(37.33±2.762)(見圖1～2)。我們選取高于DMSO組的化合物進行下一步分析。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.甘草查爾酮C;H.芫花素;I.羥基芫花素;J.穗花杉雙酮;K.洋艾素;L.銀杏雙黃酮;M.陽性對照；與空白對照組比較，**P<0.01圖1 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞增生作用的篩選

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽性對照圖2 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞增生作用共聚焦拍攝圖

3.2 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞的復(fù)制作用分析 由于胰島β細(xì)胞的增生的來源之一為已有的β細(xì)胞的復(fù)制。我們選取了5個促進β細(xì)胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]進行分析。在該模型中，胰島β-細(xì)胞特異性表達S/G2/M期的特異性蛋白Geminin，并以mAG(monomeric Azami green)-Geminin 融合蛋白的形式展現(xiàn)，經(jīng)過復(fù)制的細(xì)胞會表達綠色熒光[16]。藥物處理24 h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，淫羊藿素和陽性藥潑尼松龍能夠促進綠色β細(xì)胞的復(fù)制，數(shù)量分別為：(2.750±0.491 0)和(5.636±0.855 7)，高于對照組的(1.556±0.242 2)(見圖3～4)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.陽性對照；與空白對照組比較，*P<0.05，***P<0.001圖3 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞復(fù)制的作用分析

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.陽性對照圖4 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞復(fù)制的作用共聚焦拍攝圖

這些結(jié)果表明，在這些黃酮類藥物中，柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮能夠增加β細(xì)胞的數(shù)量。而淫羊藿素促進β細(xì)胞的增加部分來源于β細(xì)胞自身的復(fù)制。

3.3 黃酮類化合物對斑馬魚胰島β細(xì)胞的分化作用分析 由于胰島β細(xì)胞增生的另一來源為胰島前體細(xì)胞分化為成熟β細(xì)胞。我們選取了促進5個β細(xì)胞增生的黃酮類化合物，并利用指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)進行分析。在該模型中，neurod是胰島前體細(xì)胞的標(biāo)記基因之一，來源于前體細(xì)胞的新β-細(xì)胞將表達eGFP綠色熒光[18]。柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮等藥物對TgBAC(neurod:eGFP)處理24 h后，我們統(tǒng)計了誘導(dǎo)分化的β細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，柳穿魚黃素能夠促進β細(xì)胞的分化，數(shù)量分別為(5.667±0.881 9)，高于對照組的(3.000±0.577 4)(圖5～6)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖5 黃酮類化合物對斑馬魚β細(xì)胞分化作用的分析

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍圖6 黃酮類化合物對斑馬魚β細(xì)胞分化作用的分析共聚焦拍攝圖

3.4 黃酮類化合物對斑馬魚血糖水平的統(tǒng)計分析 由于脫水淫羊藿素、淫羊藿素、柳穿魚黃素、芫花素、銀杏雙黃酮、潑尼松龍能促進β細(xì)胞數(shù)量的增加，因此我們還進一步對藥物處理的斑馬魚進行血糖水平的測量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素都能夠降低斑馬魚的血糖，血糖值分別為：(153.5±2.202)、(171.2±12.25)、(171.6±6.978)pmol，明顯低于空白對照組的(288.1±22.58)pmol。這些結(jié)果說明，這幾種黃酮類藥物具有降低血糖的作用(見圖7)。

A.空白對照;B.柳穿魚黃素;C.脫水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香葉木素;F.高黃芩素(野黃芩素);G.潑尼松龍;H.陽性對照；與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖7 黃酮類化合物對斑馬魚血糖水平的影響分析

4 分析與討論

本文以斑馬魚為模型進行黃酮類化合物的藥物篩選，以期尋找到能夠促進胰島β細(xì)胞增生的藥物。這些研究結(jié)果為將來開發(fā)黃酮類化合物用于糖尿病的治療提供了參考依據(jù)。在以β細(xì)胞數(shù)量為指標(biāo)的篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)柳穿魚黃素、脫水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和銀杏雙黃酮共5種黃酮類化合物能夠促進胰島β細(xì)胞的增生。為進一步分析這些增生的胰島β細(xì)胞是通過復(fù)制還是分化而來，我們進行了進一步的探究。我們分別利用指示β-細(xì)胞復(fù)制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]和指示β-細(xì)胞分化的模型TgBAC(neurod:EGFP)，對促進β細(xì)胞增生的化合物進行藥物處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素能夠誘導(dǎo)β-細(xì)胞的復(fù)制，但并不能誘導(dǎo)前體細(xì)胞的分化，說明了淫羊藿素促進β-細(xì)胞的增加部分來源于自身的細(xì)胞復(fù)制。當(dāng)然，它促進增生的β-細(xì)胞的數(shù)量大于復(fù)制增加的細(xì)胞數(shù)量，說明還有一些其他的機制參與β-細(xì)胞數(shù)量的增加。而柳穿魚黃素促進通過誘導(dǎo)分化增加的β-細(xì)胞的數(shù)量與增生的數(shù)量大致相同，說明其促進β-細(xì)胞的增生主要歸功于誘導(dǎo)前體細(xì)胞的分化。

由于胰島β細(xì)胞的增加可能會引起胰島素分泌的增加，從而可能起到降低血糖的作用。我們在分析化合物對血糖水平影響的分析中發(fā)現(xiàn)，這些有3個促進β-細(xì)胞增生的黃酮類化合物在不同程度上都能起到降低血糖的作用。但是由于斑馬魚血糖水平的調(diào)節(jié)受到多種信號通路的影響，這些能夠促進β細(xì)胞數(shù)量增加的藥物是如何參與血糖水平的調(diào)控，還需進一步的研究。