周海濤，曹建民，胡 戈，張 靜，郭 嫻，牛衍龍，王安琪，杜 堃，魏江山，關(guān)云鵬，邵芙蓉，趙 卓△

(1. 北京聯(lián)合大學(xué)，北京 100023；2. 北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；3. 北京體育大學(xué)，北京 100084；4. 贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

脾臟作為機(jī)體最大的免疫器官，是機(jī)體細(xì)胞/體液免疫的中心。長時(shí)程、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)的過度訓(xùn)練不僅會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)明顯的疲勞感和免疫力低下，甚至還會(huì)造成脾臟結(jié)構(gòu)及功能損傷，細(xì)胞凋亡加劇是其重要原因之一[1]。氧化應(yīng)激則是誘導(dǎo)臟器細(xì)胞凋亡加劇的主要影響因素[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)可通過調(diào)控下游多種抗氧化酶的基因表達(dá)，緩解和改善氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響和損傷。同時(shí)，Nrf2通過與B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein，Bcl-2)抗氧化反應(yīng)元件的結(jié)合，調(diào)控抗/促凋亡蛋白表達(dá)，抑制和延緩細(xì)胞凋亡[3]。本課題組前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效地緩解氧化應(yīng)激[4]，抑制和延緩過度訓(xùn)練引發(fā)的過度細(xì)胞凋亡和運(yùn)動(dòng)性臟器損傷，保護(hù)臟器組織結(jié)構(gòu)和功能正常[5-6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究，通過觀察各組大鼠脾臟臟組織形態(tài)，計(jì)算脾臟系數(shù)，結(jié)合脾臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、細(xì)胞凋亡及Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化，探討姜黃素通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在緩解大鼠過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激及脾臟細(xì)胞過度凋亡、保護(hù)脾臟的作用機(jī)制，為姜黃素在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域的深度應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

63只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(49 d齡，218.4±10.7 g)，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部(生產(chǎn)合格證編號(hào) SCXK(京) 2016-0010)。北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。4 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行3 d適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，20 min/d，有3只大鼠無法完成適應(yīng)性訓(xùn)練，剔除后將剩余大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(C組，n=12)、過度訓(xùn)練組(OM組，n=24)和姜黃素+過度訓(xùn)練組(COM組，n=24)。

1.2 訓(xùn)練方案與干預(yù)

OM、COM組采用8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，具體方案[7]見圖1。訓(xùn)練過程中，若發(fā)現(xiàn)大鼠下沉不能自主上浮，計(jì)時(shí)10 s后迅速托出水面，休息5～10 min，然后繼續(xù)訓(xùn)練直至完成訓(xùn)練方案。

姜黃素(純度≥99%)購自陜西源泰生物科技公司(批號(hào)17012571)，使用0.5%羧甲基纖維素納作為助溶劑，配制姜黃素混懸液，4℃存放備用。C組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。根據(jù)文獻(xiàn)[8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，COM組大鼠姜黃素干預(yù)劑量為200 mg/(kg·d)，灌胃體積為5 ml/kg；其他組灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素納。8周訓(xùn)練期間，每天采用專業(yè)灌胃器在訓(xùn)練前1 h灌胃1次。

Fig. 1 Swimming training program of rats

Note: swimming time (min) × load percentage of the body weight (body weight %) × frequency of training

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

受運(yùn)動(dòng)量、負(fù)重、恢復(fù)時(shí)間等多種因素影響，游泳訓(xùn)練中易出現(xiàn)大鼠意外死亡現(xiàn)象。本研究中，全部訓(xùn)練結(jié)束后OM、COM組大鼠分別剩余11只和14只。末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，乙醚麻醉后頸總動(dòng)脈取血，室溫自然凝固，待血清出現(xiàn)后4℃3 000 r/min，離心10 min，分離血清，-20℃凍存待測血清睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cor)。無菌環(huán)境下，迅速取脾臟，剝離周圍脂肪組織，置于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，濾紙吸去多余液體后稱重以計(jì)算脾臟指數(shù)。切取1 cm×0.5 cm×0.2 cm脾臟組織浸入4%多聚甲醛常溫固定待觀察脾臟組織病理變化和檢測脾臟組織細(xì)胞凋亡水平、Nrf-2、血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)、Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)蛋白表達(dá)水平；另取0.3 g左右脾臟組織，準(zhǔn)確稱量重量后按照組織塊重量W(g)/勻漿介質(zhì)V(ml)為1/9的比例加入PBS緩沖液，以玻璃勻漿器在冰上充分研磨后進(jìn)行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min，取上清待測脾臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。

1.4 指標(biāo)測試方法

嚴(yán)格按照試劑盒說明書對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行測試和計(jì)算。使用儀器包括Allegra 25R臺(tái)式高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3酶標(biāo)儀(美國雷博公司)，Pannoramic MIDI全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)，r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司)，722分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠)，NR-B17CC超低溫冰箱(日本松下電器)，ISO9001電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，LEICA RM2016病理切片機(jī)(德國RM公司)。

1.4.1 脾臟指數(shù)計(jì)算 脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)×100 %

1.4.2 脾臟病理變化評(píng)價(jià) 取出固定液中的脾臟組織，經(jīng)過洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋后，制成4 μm切片，HE染色，在400倍光鏡下，觀察脾臟組織病理變化。

1.4.3 脾臟細(xì)胞凋亡檢測 采用Tunel法檢測細(xì)胞凋亡。石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)修復(fù)、破膜后，將適量末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合，覆蓋組織。切片平放于濕盒內(nèi)，37℃ 孵育2 h后加入3 %過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min。適量converter-POD 37℃孵育30 min。洗滌，二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。試劑盒由瑞士Roche公司提供。

1.4.4 蛋白免疫組化分析 采用免疫組化法檢測Nrf-2、HO-1、Bcl-2、Bax表達(dá)情況。石蠟切片脫蠟至水經(jīng)抗原修復(fù)后，加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進(jìn)行血清封閉，隨后加入一抗、二抗，進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。抗體由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.4.5 H-score評(píng)分方法 采用病理切片掃描儀將每張切片內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)數(shù)值，應(yīng)用公式計(jì)算H-score。整張切片經(jīng)過全視野數(shù)字掃描，根據(jù)細(xì)胞核顏色，將每個(gè)組織點(diǎn)的染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為像素面積并計(jì)算陽性百分比，深棕色、棕黃色、淺黃色和藍(lán)色依次判定為強(qiáng)陽性、中度陽性、弱陽性和陰性。H-score=(弱陽性細(xì)胞密度×1)+(中陽性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽性細(xì)胞密度×3)，計(jì)算后進(jìn)行組間評(píng)定。

1.4.6 其他指標(biāo)測試方法 采用放射免疫法測定血清T、Cor，酶聯(lián)免疫吸附法測定脾臟組織SOD活性、MDA濃度。以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清睪酮/皮質(zhì)酮比較

血清T濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)。血清Cor濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)。組間T/Cor與T變化趨勢一致(表1)，OM組、COM組較C組下降86.33%和47.24%。

GroupnT(ng/ml)Cor(ng/ml)T/Cor(10-2)C121.82±0.7123.81±3.918.34±4.37OM110.50±0.12??45.95±6.93??1.14±0.44??COM141.22±0.66##30.11±8.41##4.40±4.26##

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；T: Testosterone; Cor: Corticosterone

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsOM group

2.2 三組大鼠體重及脾臟指數(shù)比較

8周末大鼠體重(表2)，與C組相比，OM組呈現(xiàn)顯著性變化(P<0.05)，COM組與OM組間無顯著差異。脾臟指數(shù)，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著性降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著性升高(P<0.05)。

Groupn Body weight(g)Spleen indexC12522.26±57.431.92±0.24OM11390.67±14.53??1.50±0.23??COM14397.47±24.361.84±0.27#

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group

**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

2.3 三組大鼠脾臟組織形態(tài)比較

光鏡下觀察顯示(圖2，見彩圖頁Ⅰ)，C組大鼠脾臟組織形態(tài)正常，被膜、小梁及紅、白髓結(jié)構(gòu)完整，界限清晰。白髓淋巴細(xì)胞豐富，生發(fā)中心明顯。脾小體與脾竇結(jié)構(gòu)完整、清晰可見，脾竇未見充血、擴(kuò)張。OM組大鼠脾臟組織形態(tài)改變明顯，紅、白髓間交界模糊不清。淋巴細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、細(xì)胞間間隙狹窄。血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，內(nèi)皮疏松、脫落，同時(shí)出現(xiàn)疑似淀粉樣變性、髓外造血灶及少量色素沉積。COM組大鼠脾臟組織形態(tài)損傷程度較OM組明顯改善，紅、白髓間交界清晰程度有明顯改善，鏡下未見淀粉樣變性、髓外造血灶及色素沉積。

2.4 三組大鼠脾臟組織細(xì)胞凋亡水平比較

脾臟組織細(xì)胞凋亡水平，與C組相比，OM組凋亡加劇(P<0.01)；與OM組相比，COM組得到有效緩解(P<0.05)。脾臟組織Bcl-2表達(dá)，與C組相比，OM組下調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)顯著(P<0.05)；Bax表達(dá)，與C組相比，OM組上調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組下調(diào)顯著(P<0.05)。各組之間Bcl-2/Bax與Bcl-2表達(dá)變化趨勢一致(表3，圖3，圖4，見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 三組大鼠脾臟組織Nrf-2/HO-1表達(dá)水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

脾臟組織Nrf2表達(dá)水平，與C組相比，OM組出現(xiàn)下調(diào)，但無顯著差異(P>0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)顯著(P<0.05)；HO-1表達(dá)水平，與C組相比，OM組下調(diào)顯著(P<0.05)；與OM組相比，COM組上調(diào)極為顯著(P<0.01，表4，圖5，見彩圖頁Ⅰ)。脾臟組織SOD活性，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著降低(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05)；MDA濃度，與C組相比，OM組呈現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)；與OM組相比，COM組呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05，表4)。

3 討論

機(jī)體通過有效地識(shí)別“自己”與“異己”成分，破壞和排斥以各種方式和途徑進(jìn)入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，以及自身產(chǎn)生的各種損傷細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，充分發(fā)揮免疫機(jī)能以提高健康水平。適宜的運(yùn)動(dòng)有助于人體提高自身免疫機(jī)能、生活質(zhì)量和健康水平已成為共識(shí)。但相關(guān)研究表明過度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練易對(duì)免疫機(jī)能造成強(qiáng)烈的負(fù)面影響，不僅會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制和免疫力低下，甚至對(duì)免疫系統(tǒng)特別是人體最大的免疫器官-脾臟造成功能和結(jié)構(gòu)損傷[1,9]。

血清T/Cor比值是評(píng)價(jià)和診斷過度訓(xùn)練的金標(biāo)準(zhǔn)。OM組大鼠血清T/Cor比值較C組下降高達(dá)86.33%，大幅超過現(xiàn)有相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，說明本研究所采用的8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練方案成功的建立了過度訓(xùn)練動(dòng)物模型。體重是評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練負(fù)荷量和強(qiáng)度對(duì)機(jī)體的影響程度以及機(jī)體對(duì)訓(xùn)練的適應(yīng)情況。脾臟指數(shù)在反映脾臟發(fā)育情況的同時(shí)也可以間接的反映機(jī)體免疫水平[1]。本研究中OM組大鼠由于8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練引發(fā)過度訓(xùn)練，體重及脾臟指數(shù)較C組出現(xiàn)極顯著降低。這一結(jié)果與王雪芹[1]等人之前研究結(jié)果相一致。同時(shí)HE染色后光鏡下病理診斷發(fā)現(xiàn)OM組大鼠脾臟組織較C組發(fā)生了明顯的病理學(xué)改變。Nrf2可以作用重要調(diào)節(jié)中樞，可以在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中準(zhǔn)確、有效地調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)[11]。HO-1作為Nrf2下游重要的抗氧化蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下可以廣泛地參與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答過程[12]。本團(tuán)隊(duì)前期研究成果充分證實(shí)氧化應(yīng)激所致細(xì)胞凋亡是過度訓(xùn)練所致臟器損傷主要發(fā)生機(jī)制之一[5-6,13]。Bcl-2與Bax間的比值變化在細(xì)胞凋亡的變化趨勢中發(fā)揮重要作用[14]。本研究中與C組比較，OM組大鼠脾臟組織Nrf2表達(dá)水平雖有降低，但未出現(xiàn)顯著性變化，SOD活性及HO-1、Bcl-2表達(dá)水平、Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)顯著性降低，MDA濃度、Bax表達(dá)及細(xì)胞凋亡水平呈現(xiàn)顯著升高。以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練因運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練負(fù)荷量與強(qiáng)度過大，應(yīng)激強(qiáng)度超過大鼠自身調(diào)節(jié)能力，誘發(fā)大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，大鼠出現(xiàn)過度訓(xùn)練綜合癥及免疫損傷。同時(shí)脾臟細(xì)胞凋亡加劇引發(fā)脾臟組織功能、結(jié)構(gòu)損傷。其機(jī)制可能為，過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇引發(fā)脾臟組織中Nrf2異位和ARE結(jié)構(gòu)損傷，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響，抗氧化能力下降，自由基代謝平衡被打破，大量的自由基無法有效清除[9]。

Tab. 3 H-score of spleen apoptosis and Bcl-2/Bax in spleen tissues of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Bcl-2: B cell lymphoma-2 protein; Bax: Bcl-2 associated X protein

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

Tab. 4 H-score of Nrf2 and HO-1, SOD activity and MDA concentration in spleen tissue of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase-1; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOM group

本研究中，與OM組相比，COM組大鼠血清T/C比值呈現(xiàn)顯著升高(但較C組下降仍達(dá) 47.24%)，脾臟組織SOD活性及Nrf2、HO-1、Bcl-2表達(dá)、Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)；脾臟組織細(xì)胞凋亡水平、Bax表達(dá)、MDA濃度顯著下降；脾臟組織形態(tài)明顯改善；體重有所升高，但未呈現(xiàn)顯著差異。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明了在訓(xùn)練過程中對(duì)大鼠進(jìn)行一定劑量姜黃素干預(yù)，可以在一定程度上有效地通過延緩過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激，抑制大鼠脾臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生，保護(hù)脾臟組織的功能和結(jié)構(gòu)。其機(jī)制可能為，Nrf2表達(dá)水平的變化，可以直接影響細(xì)胞凋亡過程[13,15]。姜黃素中的酚羰基可以與Keap1中半胱氨酸殘基上的巰基發(fā)生加成反應(yīng)，促使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，推動(dòng)Nrf2的核轉(zhuǎn)位[16]，增強(qiáng)Nrf2與ARE的結(jié)合，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加[17]，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡過程[18]。

綜上所述，8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練引發(fā)大鼠過度訓(xùn)練體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇并出現(xiàn)，脾臟細(xì)胞凋亡加劇，脾臟組織發(fā)生病理改變及功能異常。訓(xùn)練期間給予姜黃素可以通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，在一定程度上有效緩解過度訓(xùn)練引發(fā)的氧化應(yīng)激，抑制大鼠脾臟細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)脾臟組織的功能和結(jié)構(gòu)，預(yù)防和延緩免疫損傷。