黎鵬 李淑賢 鄧子亮 郭洪勝 王森 何素輝(通訊作者)

(1 廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組胚教研室 廣東 東莞 523808)

(2 廣東醫(yī)科大學第二臨床學院 廣東 東莞 523808)

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國高發(fā)病率的惡性腫瘤，嚴重危害人們生命健康。目前植物來源的藥物已被廣泛應用于腫瘤的預防與治療，其中五味子乙素（schisandrin B，Sch B）就是一種備受關注的抑制腫瘤增殖的中藥。研究發(fā)現(xiàn)，Sch B具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[1-2]，可以抑制多種癌癥如乳腺癌、肺癌和膽管癌等[3-5]腫瘤細胞的增殖和遷移。Sch B對HCC作用的報道比較少。因此，本課題組初步探討了Sch B對HCC細胞體外增殖的影響，為進一步進行HCC的藥物治療提供實驗基礎和潛在的藥物分子。

1.材料和方法

2.1 材料

人HepG2細胞和MHCC97H細胞為本實驗室保存。胎牛血清、細胞培養(yǎng)基（DMEM）購買自Gbico公司。胰蛋白酶-EDTA消化液購自Life technologies公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)購自碧云天生物工程有限公司；五味子乙素和DMSO購自北京索萊寶科技有限公司；細胞增殖檢測用CCK-8試劑盒由購自Dojindo。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 HepG2和MHCC97H細胞用DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、含有5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。給藥前24h取對數(shù)生長期的HepG2和MHCC97H細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后顯微鏡下進行細胞計數(shù)，按每孔3×105個細胞的數(shù)量，以每孔2mL細胞懸液鋪于6孔板。實驗分對照組和Sch B實驗組（低劑量50μmol/L和高劑量100μmol/L）。

1.2.2 藥物制備及給藥 將1mLDMSO加入20mg Sch B粉劑中充分溶解，制成濃度為0.05mol/L的Sch B工作液。HepG2和MHCC97H細胞于6孔板培養(yǎng)24h后，對照組分別加入EMSO試劑2μL和4μL，五味子乙素實驗組分別加入2μL（終濃度50μmol/L）和4μL（終濃度100μmol/L）的Sch B工作液。繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8實驗 以每孔5×103細胞的數(shù)量，100μL細胞懸液鋪板于96孔板中，每組細胞5個復孔，給藥后24h、48h、72h時分別加入CCK8每孔10μL，1～2h后酶標儀檢測450nm吸光度值并計算細胞增殖抑制率。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 Sch B處理的肝癌HepG2和MHCC97H細胞增殖能力下降

CCK8試驗結(jié)果顯示，加藥處理24h、48h、72h后，Sch B組肝癌細胞的增殖與對照組相比，HepG兩組在Sch B 50μmol/L劑量，于24h、48h、72h分別抑制了約19.62%，19.05%，11.33%，24h～72h差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在Sch B 100μmol/L劑量，于24h、48h、72h分別抑制了約4.35%，11.67%，16.03%，d2～72h差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MHCC97H組在Sch B 50μmol/L劑量，24h、48h、72h分別抑制了約4.43%，9.66%，26.84%，僅有72h差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在Sch B 100μmol/L劑量，于24h、48h、72h分別抑制了約24.38%，33.56%，52.36%，24h～72h差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1A、B。本結(jié)果提示Sch B可抑制肝癌HepG2和MHCC97H細胞體外增殖能力。

另外，對比同樣濃度Sch B對兩種細胞增殖影響的差異，在50μmol/L給藥處理的結(jié)果中，Sch B對兩種肝癌細胞株的增殖影響的差異在24h和72h有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），48h則無差別；而在100μmol/L濃度，Sch B對兩種肝癌細胞株的增殖影響的差異在24h～72h均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1C、D。

2.2 Sch B對肝癌HepG2和MHCC97H細胞形態(tài)的影響

SCH B組HepG2細胞和MHCC97H在加藥處理培養(yǎng)24h、48h和72h后，和對照組相比較，細胞數(shù)量均有所減少，細胞變小，死亡細胞增多。以HepG2細胞在50μmol/L的 SCH B加藥處理，以及MHCC97H細胞100μmol/L的 SCH B加藥處理后，細胞增殖抑制尤為明顯，如圖E-P所示。

圖 Sch B加藥處理的HepG2和MHCC97H細胞增殖（%）和細胞形態(tài)(×200)

3.討論

五味子乙素（schisandrin，Sch B）是從中藥五味子中提取出來的活性物質(zhì)，分子量是400.46，屬木脂素類，是五味子的主要活性成分之一[6]，近年來研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用，誘導腫瘤細胞分化及凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多耐藥性、增加其他抗腫瘤藥物的敏感性、抑制腫瘤血管生成等機制來抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)Sch B能夠促進阿霉素在人肝癌細胞系(SMMC7721細胞)誘導的凋亡[7]。本研究為Sch B對HCC細胞抗腫瘤作用的補充，進一步在兩株人肝細胞癌HepG2細胞和MHCC97H細胞中探討其對增殖的影響。

本實驗CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sch B組肝癌細胞的增殖與對照組相比，兩種劑量的HepG2細胞組和HCC97H細胞組都有增殖抑制。另外，對比同樣濃度Sch B對兩種細胞增殖影響的差異，并且在50μmol/L Sch B作用下，肝癌HepG2細胞受到增殖抑制比MHCC97H細胞的早；而在100μmol/L濃度，Sch B對兩種肝癌細胞株的增殖影響的差異均有統(tǒng)計學意義，說明Sch B作用于肝癌MHCC97H細胞發(fā)揮的增殖抑制比HepG2細胞的出現(xiàn)得早及明顯。鏡下觀察肝癌細胞形態(tài)和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)Sch B組細胞在加藥處理后，細胞數(shù)量均有所減少，細胞變小，死亡細胞增多，從形態(tài)學上進一步證實Sch B確實可以抑制肝癌細胞的體外增殖能力，尤其是對MHCC97H細胞。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，Sch B能有效地抑制HepG2細胞和MHCC97H細胞的細胞增殖能力，為將來進一步深入研究分子機制打下基礎，也為肝癌防治提供潛在的新型藥物分子。