張馨默，劉麗萍*

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000）

花藥培養(yǎng)是利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將花藥進行無菌操作接種到人工培養(yǎng)基上，通過改變小孢子的發(fā)育途徑，使其誘導(dǎo)分化，進行連續(xù)的有絲分裂，形成細胞團，繼而形成愈傷組織后胚狀體，最終分化成完整的植株。印度Guha等最早針對毛曼陀羅的離體花藥，誘導(dǎo)出單倍體植株，而后花藥培養(yǎng)法被運用到煙草上，并受到世界的廣泛關(guān)注。此后，人們陸續(xù)開展了對觀賞性植物的花藥培養(yǎng)研究。

花藥培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用價值：一是可縮短育種年限，加速育種進程。通過對獲得的單倍體植株進行染色體加倍，從而獲得純合的二倍體植株；二是對育種研究提供原材料。通過鑒定和選擇滿意的基因組合，對遺傳變異方面的研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)；三是提供了外源基因的轉(zhuǎn)化受體，從而利于外源基因的整合與表達。

矮牽牛（Petunia hybrid Vilm），又名碧科茄、靈芝牡丹、撞羽牽牛等，為茄科矮牽牛屬一年生或多年生的半蔓性草本花卉。其品種豐富、系列繁多，包括阿根廷系列、云系列、夢幻系列、魅力系列、地毯系列、梅林系列等。因其具有鮮艷豐富的色彩、較長的花期和適應(yīng)能力、較好的耐熱性及觀賞性，被廣泛地用于城市綠化和室內(nèi)盆栽等。在種子的獲取方面所面臨的問題有：播種繁殖，采種困難；進口雜交種，價格昂貴；扦插繁殖，成活率低等。

因此，針對矮牽牛的需求量的增加以及需求品種的多樣化，通過花藥培養(yǎng)可快速獲得純合二倍體以及隱形突變體，并能縮短育種周期、提高選擇效率。而目前在矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)的技術(shù)研究方面還遠不如禾本科植物成熟，例如，水稻、小麥等。通過本試驗研究，旨在明確矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)的最佳培養(yǎng)條件、總結(jié)有關(guān)花藥培養(yǎng)中的影響因素和培養(yǎng)過程中應(yīng)注意到的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選擇

以矮牽?！懊妨窒盗小奔t色品種為試驗材料。于晴天上午10時從健壯無病毒的植株中采集花蕾，首先對小孢子發(fā)育時期進行觀察，通過醋酸洋紅染色，再進行壓片鏡檢，確定小孢子的發(fā)育時期與花蕾直徑的相關(guān)性。選取小孢子發(fā)育時期處于單核靠邊期的花蕾做試驗，花蕾直徑在1.5～2.0mm。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

MS、B5、N6 基本培養(yǎng)基與 2，4-D 、6-BA、NAA、IBA、IAA等生長調(diào)節(jié)劑按照不同比例混合，部分培養(yǎng)基中需加入瓊脂和麥芽糖，培養(yǎng)基pH值為5.8。培養(yǎng)室溫度為25±2℃，愈傷組織的誘導(dǎo)需要暗培養(yǎng)，愈傷組織分化的光照周期為14h/d，光照強度為3000lx。

1.3 預(yù)處理與接種

首先剝?nèi)セㄝ?，? mol/L的HCL處理60s后用流水清洗數(shù)遍，再用70%乙醇浸泡2 min，流水沖洗干凈。用無菌蒸餾水沖洗3次，大約15 min。將處理后的花蕾剪下，放在4℃的恒溫冰箱中冷藏，冷藏時間設(shè)置4組對照，即12h、24h、48h、72h。之后在干凈無菌的實驗臺上，使用70%的酒精處理花蕾1 min，無菌水沖洗3次（約15 min）。最后用0.1%的HgCl2消毒，消毒時間設(shè)置 4組對照，即 6min、8min、10min、12 min，無菌水沖洗 5次（約30 min），后用吸水紙吸干花蕾表面的水分。接種前使用滅菌后的解剖刀或鑷子小心地剝?nèi)セò辏〕龌ㄋ?，去除花絲。將花藥散落接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置3種，即MS、B5、N6且與不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑、瓊脂和麥芽糖混合配制，每個平皿中接種10個花藥，每個處理接種5瓶，用parafilm封口膜封好平皿，進行暗培養(yǎng)。每7d觀察一次愈傷組織的誘導(dǎo)情況，30d后統(tǒng)計最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。

1.4 愈傷組織的分化

愈傷組織誘導(dǎo)完成后，需在新配置的培養(yǎng)基（即3種基本培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑混合配置）中進行光培養(yǎng)，每個瓶皿中接種5塊愈傷組織，每處理接種10瓶。每10d觀察一次愈傷組織的分化情況，30d后統(tǒng)計最佳分化培養(yǎng)基的分化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾直徑與小孢子發(fā)育階段的關(guān)系

通過壓片鏡檢可觀察出：當花蕾直徑≤1.5mm時，小孢子處于四分體時期，此時的花藥呈綠色扁平狀；花蕾直徑在1.5～2.0mm時，小孢子處于單核靠邊時期，此時的花藥呈綠色略飽滿狀，適合做培養(yǎng)材料；當花蕾直徑≥2.0mm時，小孢子處于雙核時期，此時的花藥逐漸變成黃色呈飽滿狀。

2.2 冷藏時間對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

接種前，對花藥進行低溫預(yù)處理，有利于提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。試驗表明，隨著冷藏時間的增加，誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢。在4組對照組中，冷藏48h后的誘導(dǎo)率最高，達27.54%。48h后誘導(dǎo)率降低的原因可能是花藥失水受損而導(dǎo)致營養(yǎng)物供不應(yīng)求。

2.3 0.1%HgCl2的消毒時間對花蕾污染的影響

對花蕾進行HgCl2滅菌消毒，可減少污染、預(yù)防花藥受損。試驗結(jié)果顯示消毒時間與花蕾的污染率呈反比，最終可達到零污染的效果。但是HgCl2存在毒性，對花蕾作用時間過長會毒害細胞。消毒10 min為最佳滅菌時間，此時的污染率基本降低到10%左右，污染率較低且對細胞基本無損傷，也可保護花藥免受污染。

2.4 不同碳源對愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

不同種類的培養(yǎng)基中分別添加蔗糖、麥芽糖、白砂糖作為碳源，對比愈傷組織誘導(dǎo)及分化效果好的碳源種類與濃度。試驗得出麥芽糖對提高愈傷組織的誘導(dǎo)率最明顯，當麥芽糖的濃度為20g/L時的誘導(dǎo)率為29.02%，其次是蔗糖，而白砂糖的效果不佳。

2.5 不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

培養(yǎng)基的種類對花藥愈傷組織的誘導(dǎo)、分化起著重要的作用。本試驗通過對N6、B5、MS三種基本培養(yǎng)基的比較研究，篩選確定出最適合誘導(dǎo)出愈傷組織的培養(yǎng)基N6，其誘導(dǎo)率最高，而B5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率則不是很明顯，MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率比較適中。對于最適分化培養(yǎng)基的選擇，試驗表明MS基本培養(yǎng)基比N6基本培養(yǎng)基的分化率高，愈傷組織的分化效果明顯。

2.6 參與配制的生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度對誘導(dǎo)率及分化率的影響

生長調(diào)節(jié)劑是通過很低的濃度來促進或抑制植物生命活動中的某些過程，所以往往起到量小作用大的效果，本試驗中所用到的生長調(diào)節(jié)劑包括：生長素2，4-D、IBA、IAA，細胞分裂素6-BA、NAA。在比較不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑組成中，發(fā)現(xiàn)對于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳組合為N6+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA其誘導(dǎo)率可達36.82%，此時其基部可產(chǎn)生大量的愈傷組織；而對于分化培養(yǎng)基的最佳組合為MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA其分化率可達43.75%，此時愈傷組織分化出芽量較高并且可保持褐化量較少。誘導(dǎo)培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基的配制方法，見表1及表2。

表1 N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方（單位：g/L）

表2 MS分化培養(yǎng)基配方（單位：g/L）

試驗表明，生長調(diào)節(jié)劑的濃度不能過高，當其超出一定值時就會抑制愈傷組織的誘導(dǎo)效果或分化效果。如細胞分裂素6-BA對提高愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著的效果，但是當其濃度高于1.5mg/L時又會抑制愈傷組織的形成。

3 結(jié)論

本試驗通過一系列的對照研究，確定出矮牽牛花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方。其中，在培養(yǎng)過程中起重要作用的有對花藥的選擇方面、對花藥接種前的處理方面，以及對培養(yǎng)基配制中各成分與濃度劑量的確定方面。研究得出：花蕾直徑在1.5～2.0mm的花藥處于單核靠邊期的較好；預(yù)處理中，冷藏溫度在4℃、時間在48h，滅菌時間在10min為宜；培養(yǎng)基中的碳源選擇麥芽糖對提高愈傷組織的誘導(dǎo)率效果比蔗糖和白砂糖明顯；生長調(diào)節(jié)劑針對不同作用的培養(yǎng)基的選擇和濃度確定是不同的，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中需1.5mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA，分化培養(yǎng)基中則需0.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA。

矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)成功的關(guān)鍵在于培養(yǎng)過程中的無菌操作。一是保證花藥的無菌獲取，即在對花蕾進行預(yù)處理消毒滅菌時，應(yīng)保持實驗臺的超凈無菌。而且牽?；ǖ幕ɡ俦砻姘欢探q毛，易受污染，所以應(yīng)保證對花蕾或花藥進行轉(zhuǎn)移時周圍環(huán)境的潔凈無菌、無污染；二是保證對誘導(dǎo)后的愈傷組織進行分化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移時的無菌操作。

不同梯度的對比試驗組是研究有關(guān)影響因素的重要方法，其中涉及控制唯一變量的原則，以及試驗現(xiàn)象的定期觀察、試驗結(jié)果的判斷與數(shù)據(jù)計算。本試驗中涉及到數(shù)據(jù)計算包括：誘導(dǎo)率=成功誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量/接種花藥的數(shù)量；分化率=成功分化的愈傷組織數(shù)量/接種愈傷組織的數(shù)量。

一是花藥培養(yǎng)可實現(xiàn)矮牽?；ǖ目焖倥嘤⒖s短其繁殖周期，但仍存在繁殖率低的問題。主要原因在于部分花胚的發(fā)生率較低，從而降低了其應(yīng)用價值，所以有待于針對其基因方面進行深入研究；二是在小孢子的發(fā)育調(diào)控機理方面的研究還不夠成熟，若能明確此方面的機理，將有助于進行對目的性狀的篩選，可增加定向突變；三是花藥培養(yǎng)過程難免會受矮牽牛植物本身的體細胞影響，可通過適當?shù)母淖兩L調(diào)節(jié)劑的種類和碳源的濃度來減緩其影響，但對于解決問題的關(guān)鍵仍需進一步的深入研究。