葉耀輝 鐘魯龍 雷松波 王金寶

（福建省寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建寧德 355017）

豆粕是現(xiàn)代養(yǎng)殖中使用最普遍的蛋白質(zhì)原料，同時(shí)，豆粕本身含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植酸鹽等[1]，降低了畜禽對(duì)飼料的利用效率。利用微生物固態(tài)發(fā)酵的方法，可以很好地去除豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、植酸、脂肪氧化酶等[2]，選擇合適的微生物組合，也可以提高豆粕粗蛋白、小分子蛋白、多肽等的含量[3,4]，提高豆粕的營養(yǎng)價(jià)值。發(fā)酵豆粕一般直接在飼料中添加使用，可提高畜禽生長性能[5,6]，降低水產(chǎn)飼料中魚粉使用量等[7]。發(fā)酵所用微生物菌株和發(fā)酵后干燥工藝對(duì)發(fā)酵豆粕營養(yǎng)價(jià)值影響很大，特別是發(fā)酵后的干燥工段大大降低了發(fā)酵豆粕的風(fēng)味和適口性，且會(huì)損失部分益生菌和益生物質(zhì)。近年來，隨著微生物與固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的普及，一些規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)開始在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)直接進(jìn)行豆粕固態(tài)簡易發(fā)酵，以最大程度保留發(fā)酵豆粕的酸香風(fēng)味和益生物質(zhì)，主要在幼齡動(dòng)物和種豬飼料中添加使用。由于養(yǎng)殖場(chǎng)技術(shù)力量有限，所選菌種一般是網(wǎng)購的復(fù)合菌劑，發(fā)酵條件也比較簡陋，一般是將豆粕直接裝在桶或者袋子中簡易發(fā)酵7～15 d后直接使用，對(duì)最終發(fā)酵后的豆粕營養(yǎng)組分變化不清楚，導(dǎo)致現(xiàn)場(chǎng)制作的發(fā)酵豆粕質(zhì)量層次不齊，甚至存在霉菌超標(biāo)的問題，反而對(duì)動(dòng)物有害。本研究選擇了用于豆粕發(fā)酵的幾種常用益生菌，分別對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理，研究不同微生物在豆粕發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一系列微生物和生化指標(biāo)變化的差異，評(píng)估不同發(fā)酵條件下可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)酵提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（編號(hào)：CICC6075）；釀酒酵母購于安琪酵母股份有限公司；枯草芽孢桿菌購于福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司。豆粕購于泉州福海糧油工業(yè)有限公司；硫酸銨為分析純級(jí)，其他試劑均為工業(yè)級(jí)。

1.2 發(fā)酵液制備

嗜酸乳桿菌制備：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、無水乙酸鈉0.5%、檸檬酸鈉0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸銨0.02%、吐溫0.1%、水1 000 mL，pH值調(diào)至6.2～6.6之間，發(fā)酵48 h左右停止發(fā)酵，將發(fā)酵液用蒸餾水調(diào)制到菌數(shù)為109CFU/mL數(shù)量級(jí)，備用。

枯草芽孢桿菌制備：將菌粉加蒸餾水調(diào)制到菌濃度為109CFU/mL數(shù)量級(jí)，備用。

釀酒酵母制備：將安琪酵母加蒸餾水調(diào)節(jié)菌濃度到109CFU/mL數(shù)量級(jí)，備用。

1.3 基礎(chǔ)物料配制及接種發(fā)酵

基礎(chǔ)物料配制與接種：豆粕與水按2∶1比例，枯草芽孢桿菌菌液、嗜酸乳桿菌發(fā)酵液、釀酒酵母菌液分別按豆粕重量的10%進(jìn)行接種。分別在20℃、37℃進(jìn)行厭氧固態(tài)發(fā)酵，在第1 d（D1）、第3 d（D3）、第7 d（D7）、第15 d（D15）取樣進(jìn)行分析，測(cè)定接種微生物活菌總數(shù)、霉菌總數(shù)以及小分子蛋白等生化指標(biāo)。

1.4 小分子蛋白含量測(cè)定

取1 g發(fā)酵豆粕溶于50 mL蒸餾水中，調(diào)pH值至4.5后進(jìn)行沉淀，4 000 r/min離心10 min，取上清液，用Folin-酚法測(cè)定蛋白含量[8]。

1.5 垂直板狀十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）

參照Laemmli方法[9]，分離膠質(zhì)量濃度為125 g/L，濃縮膠質(zhì)量濃度為44 g/L，電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍(lán)染色。豆粕蛋白抽提液用非還原電泳處理液進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同接種菌株發(fā)酵過程微生物指標(biāo)變化情況

根據(jù)發(fā)酵實(shí)際條件，豆粕不經(jīng)任何處理，與水按比例混合后，分別接種不同益生菌，厭氧發(fā)酵，在不同時(shí)間取樣測(cè)定相應(yīng)的微生物指標(biāo)。

由表1可知，10%接種量接種不同益生菌，不同的溫度條件下，益生菌生長情況差異很大。20℃時(shí)，3種菌株的生長均不明顯，1周后，菌株數(shù)量普遍下降，說明溫度較低時(shí)，豆粕發(fā)酵程度很低，達(dá)不到發(fā)酵的目的。在37℃條件下，無論芽孢類、乳酸菌類還是酵母類，均生長迅速，尤其以芽孢桿菌萌發(fā)生長最快，持續(xù)較長時(shí)間時(shí)活性菌體數(shù)仍然很高。接種乳酸菌和酵母菌1周后，有效活性菌數(shù)明顯減少。若希望豆粕在發(fā)酵中能夠提供有效的益生微生物，則發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間都應(yīng)該控制在合適范圍內(nèi)。從表觀性狀看，芽孢桿菌類發(fā)酵豆粕顏色偏紅，氣味一般；乳酸菌發(fā)酵豆粕有酸香味，味道最佳；酵母菌發(fā)酵豆粕則有酒香味，時(shí)間越長，酒味越濃，不利于動(dòng)物采食。

表1 接種微生物菌數(shù)變化情況

簡易發(fā)酵豆粕外觀看基本沒有霉菌，但仍然有霉菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，在上述條件下，霉菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果如表2。

表2 霉菌總數(shù)變化情況

接種益生菌7 d和15 d時(shí)，表觀觀察未發(fā)現(xiàn)霉變現(xiàn)象。表2取樣測(cè)定結(jié)果顯示，1周后，接種芽孢桿菌和酵母菌豆粕中霉菌的數(shù)量均有增加，尤其是在37℃條件下，霉菌含量明顯上升。15 d時(shí)，接種枯草芽孢桿菌的豆粕霉菌總數(shù)已接近霉菌的限量標(biāo)準(zhǔn)。說明在簡易發(fā)酵操作實(shí)踐中，雖然發(fā)酵豆粕外觀看不出太大的差異性，但豆粕內(nèi)部已經(jīng)有不同數(shù)量的霉菌，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，必然會(huì)造成發(fā)酵豆粕霉菌毒素含量的增加，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有一定的負(fù)面作用。從微生物指標(biāo)看，養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)酵豆粕時(shí)必須嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間，尤其在夏季高溫時(shí)發(fā)酵時(shí)間應(yīng)控制在1周之內(nèi)。

2.2 不同接種菌株發(fā)酵過程生化指標(biāo)變化情況

從生產(chǎn)實(shí)際來看，對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵主要是希望解決豆粕抗原的問題。豆粕中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子是抗原蛋白，利用微生物對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理，可以降解豆粕中的7S和11S球蛋白[10]，生成具有益生功能的活性小分子物質(zhì)。不同微生物對(duì)豆粕固態(tài)發(fā)酵后的小分子含量差異很大，結(jié)果見表3。

表3 小分子蛋白的差異

由表3可知，芽孢類微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕后產(chǎn)生的小分子蛋白最多，可達(dá)8%以上，其次是乳桿菌類發(fā)酵豆粕，最次是釀酒酵母。20℃時(shí)，從小分子蛋白含量變化情況看，豆粕發(fā)酵程度非常低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于37℃條件下的發(fā)酵水平。從時(shí)間上看，在第3 d后，小分子蛋白的含量雖略有上升，但基本上變化不大，顯示前3 d的豆粕發(fā)酵至關(guān)重要，此段時(shí)間，菌株處于最佳的活力狀態(tài)，且在分子水平對(duì)豆粕的發(fā)酵已基本完成。

2.3 不同接種菌株發(fā)酵豆粕蛋白SDS-PAGE比較分析

不同微生物發(fā)酵豆粕7天后，分別取樣抽提蛋白，經(jīng)非還原電泳處理液處理后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖1所示。

圖1 不同微生物發(fā)酵豆粕蛋白電泳圖

從圖1可以明顯看出，37℃條件下，芽孢桿菌發(fā)酵處理后的豆粕大分子蛋白條帶明顯變淺，大部分被發(fā)酵處理成低于20 KDa分子量的小分子蛋白，其次是乳酸菌和酵母菌。而在20℃條件下，3種微生物發(fā)酵豆粕對(duì)大分子蛋白的酵解程度均比較低。相關(guān)研究表明，豆粕中大分子蛋白質(zhì)含量與小腸絨毛高度隱窩深度呈負(fù)相關(guān)[11]，這也是發(fā)酵豆粕降低大分子蛋白含量后有利于改善幼畜腸道平衡的原因。

本研究數(shù)據(jù)顯示，用不同種類的微生物對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理，均可以不同程度地降低豆粕主要抗原因子7S和11S球蛋白的水平，相應(yīng)地提高發(fā)酵豆粕的小分子物質(zhì)含量，從而使發(fā)酵豆粕應(yīng)用于仔豬時(shí)，可以降低腹瀉率，提高消化酶活性，促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育，提高斷奶仔豬生長性能[12]。應(yīng)用于肉雞和肉鴨則可以提高增重，改善料重比，并降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌數(shù)量，改善腸道微環(huán)境[13,14]。乳酸菌和酵母菌類微生物可以明顯提高發(fā)酵豆粕的香味和適口性，經(jīng)常作為復(fù)配菌種，應(yīng)用于多菌種發(fā)酵豆粕的研究中[15]。

3 結(jié)論

發(fā)酵豆粕應(yīng)用效果的差異關(guān)鍵在于發(fā)酵微生物的選擇。在養(yǎng)殖場(chǎng)簡易發(fā)酵時(shí)，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際需要，選擇合適的微生物菌株或者菌株組合。芽孢類微生物發(fā)酵有助于提高小分子蛋白的含量，乳酸菌類微生物則有助于提高豆粕適口性。發(fā)酵時(shí)應(yīng)注意溫度與時(shí)間的控制，夏季發(fā)酵時(shí)間應(yīng)不超過1周，冬季發(fā)酵時(shí)間適當(dāng)延長到2周或以上。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)配置簡易的微生物測(cè)定工具，隨時(shí)監(jiān)控豆粕發(fā)酵過程的微生物變化，防止?jié)撛诘奈⑸锇踩L(fēng)險(xiǎn)。不同微生物對(duì)豆粕的酵解程度不同，發(fā)酵豆粕的利用價(jià)值差異很大。工業(yè)化制備發(fā)酵豆粕時(shí)，一般采用復(fù)合菌種進(jìn)行好氧或厭氧發(fā)酵，在降低豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高豆粕功能性多肽含量等方面均有很好的效果。