李 艷 高 靜,2,3 何曉燕 嚴(yán)來(lái)喜

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

甲殼素又名幾丁質(zhì)，是地球上蘊(yùn)藏量最豐富的有機(jī)物之一。如圖1所示，甲殼素是由β-1,4-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接起來(lái)的線性高分子多糖[1]，脫乙酰度達(dá)到50%以上的甲殼素又被稱為殼聚糖[2]。甲殼素及殼聚糖因具有優(yōu)異的生物相容性、生物降解性和熱化學(xué)穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織等領(lǐng)域[3]。地球上每年甲殼素的生物合成量約為100億t，是年產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的可再生天然資源[4-5]。海產(chǎn)品加工副產(chǎn)物蝦、蟹殼是甲殼素的主要原料，占生物合成甲殼素總量的80%[6]。從水產(chǎn)品加工下腳料中提取回收甲殼素不僅可以緩解資源浪費(fèi)，而且使副產(chǎn)物得到高值化利用[7]。

圖1 甲殼素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

蝦殼主要含有甲殼素15%～25%、碳酸鈣25%～50%、蛋白質(zhì)35%～50%[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，工業(yè)提取甲殼素采用強(qiáng)酸脫碳酸鈣和堿脫蛋白質(zhì)。此方法對(duì)酸、堿需求量大，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。而且，堿處理會(huì)導(dǎo)致甲殼素部分脫乙酰和聚合物水解，使甲殼素分子量降低[8-9]。近年來(lái)，微生物發(fā)酵法和酶法提取甲殼素因反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好和耗能少等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，但提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低和脫蛋白不充分等缺陷限制了其工業(yè)化應(yīng)用[10]。

離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成的低溫熔融鹽，又稱室溫熔鹽，具有可設(shè)計(jì)性強(qiáng)和熱穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[11-13]。對(duì)纖維素、甲殼素等多糖有很強(qiáng)的溶解能力[14-16]。近年來(lái)，利用離子液體從蝦殼中提取回收甲殼素的研究得到了廣泛關(guān)注[17-19]。文章主要從甲殼素和蝦殼在離子液體中的溶解特性、甲殼素提取物成分分析以及結(jié)構(gòu)表征3個(gè)方面綜述以離子液體為溶劑從蝦殼中提取回收甲殼素的研究進(jìn)展，旨在為對(duì)蝦加工下腳料的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 甲殼素在離子液體中的溶解性

1.1 離子液體的陰離子對(duì)甲殼素溶解度的影響

離子液體(ILs)具有“可設(shè)計(jì)性”，不同陰、陽(yáng)離子組合的離子液體對(duì)物質(zhì)的溶解能力不同[20-21]，表1列舉了甲殼素在多種離子液體中的溶解度。離子液體的氫鍵接受能力(β值)受其陰離子支配，具有較強(qiáng)氫鍵接受能力的陰離子(如Ac-、Br-、Cl-)容易與甲殼素氨基上的H原子形成穩(wěn)定的氫鍵，從而促進(jìn)甲殼素的溶解[29]。Qin等[23]發(fā)現(xiàn)在100 ℃、19 h條件下甲殼素在[Emim]Ac中的溶解度可達(dá)15.2%，而在[Emim]Cl中的溶解度僅為4.2%。類似的，甲殼素在[Amim]Cl和[Amim]Ac中的溶解度分別為0.5%[24]和5.0%[25]。一般情況下，離子液體的陰離子對(duì)甲殼素溶解能力順序?yàn)椋篈c->Cl-。

表1 甲殼素在不同離子液體中的溶解度?

? “-”表示文獻(xiàn)中未指出。

1.2 離子液體的陽(yáng)離子對(duì)甲殼素溶解度的影響

咪唑類離子液體溶解甲殼素的能力較吡咯烷、哌啶和哌嗪類離子液體強(qiáng)，因?yàn)檫溥蚧x子液體結(jié)構(gòu)中包含1個(gè) 5元環(huán)，比6元環(huán)組成的離子液體顯示出更高供給質(zhì)子的能力和更強(qiáng)的酸性[29]。此外，由于陽(yáng)離子疏水性和黏度均隨烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增大，不利于分子的溶解[30]。不僅如此，受陽(yáng)離子烷基鏈官能團(tuán)的影響，甲殼素在Cl-基離子液體中的溶解度關(guān)系為[Emim]+>[Amim]+>[C2OHmim]+[23-24]。因此，體積小、極性強(qiáng)的陽(yáng)離子[Emim]+能夠與甲殼素中—OH的氧原子和—NH 的氮原子產(chǎn)生較強(qiáng)的氫鍵作用。

如圖2所示，離子液體溶解甲殼素的機(jī)理為：陰離子與甲殼素的乙酰胺基和羥基形成氫鍵，削弱了甲殼素分子內(nèi)和分子間氫鍵作用，導(dǎo)致甲殼素分子鏈的扭曲和剝落。同時(shí)，離子液體的陽(yáng)離子穿透甲殼素分子鏈之間的空隙，防止剝離后結(jié)晶相的恢復(fù)。最后，甲殼素鏈以完全分離的分子形式分散在離子液體中[31]。

2 離子液體提取蝦殼中甲殼素的工藝

[Emim]Ac等離子液體對(duì)甲殼素的良好溶解性，為提取蝦殼中甲殼素的良好溶劑。一般情況下，以離子液體為溶劑提取蝦殼中甲殼素的工藝流程如圖3所示。離子液體與蝦殼粉按照一定比例混合后，在適當(dāng)加熱溫度和攪拌時(shí)間處理下能夠溶解礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和甲殼素，向混合體系加入反溶劑(水等[28,32])后，甲殼素可沉淀出來(lái)，而礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)則溶解在離子液體廢水溶液中被有效脫除。表2總結(jié)了不同提取溶劑、提取溫度和時(shí)間、固液比等條件下甲殼素的得率和純度。

圖2 離子液體溶解甲殼素的結(jié)構(gòu)模型

圖3 離子液體提取蝦殼中甲殼素的工藝流程圖

2.1 離子液體種類的影響

對(duì)甲殼素有較好溶解能力的離子液體也顯示出良好的甲殼素提取效果，如利用[Emim]Ac從蝦殼中提取甲殼素得率為16.2%[36]；而[Amim]Cl對(duì)甲殼素的溶解度較低(0.5%)[25]，相對(duì)應(yīng)地得到的甲殼素僅為1.57%[37]。利用成本較低的銨基類離子液體溶解蝦殼可以獲得與咪唑類離子液體相當(dāng)?shù)募讱に禺a(chǎn)量和純度。例如，[NH3OH]Ac獲得的甲殼素純度>80%[30]。呂興梅等[32]利用一種季銨鹽類離子液體一步脫除蝦蟹殼中的碳酸鈣和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，獲得甲殼素的純度>85%。由表2可知，含Ac-的離子液體對(duì)甲殼素的提取率比Cl-和P-都高，另外咪唑類離子液體[Emim]Ac比銨基類離子液體[DIPEA]Ac、[DMBA]Ac具有更高的甲殼素提取率。

表2 不同溶解條件下甲殼素得率和純度的比較?

? [Emim]DMP指1-乙基-3-甲基咪唑磷酸三甲酯；“-”表示參考文獻(xiàn)中未指出或未測(cè)定。

2.2 提取溫度和時(shí)間的影響

離子液體的黏度大小主要由氫鍵能和范德華力大小決定[41]，溫度對(duì)離子液體的黏度影響很大，大多數(shù)離子液體的黏度隨溫度的升高而急劇下降，從而影響分子的傳質(zhì)速度和溶解性[42]。Setoguchi等[43]以[Amim]Br為溶劑從蟹殼中提取甲殼素，發(fā)現(xiàn)得率隨溫度的升高而增大，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。周雅文等[37]指出蝦殼在離子液體[Amim]Cl中的溶解度隨溫度的升高先增大后下降，且隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。過(guò)高的溫度和過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蝦殼中有機(jī)成分的降解，離子液體黏度增加，從而不利于甲殼素的提取。由表2 可知，甲殼素的提取通常需要在較高的溫度條件下(100～110 ℃)，與銨基類離子液體相比，咪唑類離子液體提取甲殼素需要的時(shí)間較短(約為1 h)。

2.3 提取體系固液比的影響

傳統(tǒng)酸堿法顯示蝦殼的脫礦程度受固液比影響，在1∶3～1∶12(g/mL)固液比范圍內(nèi)，隨固液比的增大蝦殼脫礦率增加[34]。固液比通過(guò)影響溶質(zhì)與溶劑間的相互滲透作用而影響蝦殼在離子液體中的溶解。高靜等[35]發(fā)現(xiàn)1∶5～1∶25(g/mL)固液比范圍內(nèi)，蝦殼在[Emim]Ac中的溶解度隨固液比的增大而逐漸增加。一般情況下甲殼素的提取體系選擇固液比在1∶20～1∶25(g/mL)的提取效果最佳。

3 甲殼素提取物的化學(xué)組成分析

甲殼動(dòng)物的外骨骼是由一個(gè)3層的角質(zhì)層構(gòu)成的，內(nèi)層由甲殼素與蛋白質(zhì)包裹組成，甲殼素與礦物質(zhì)一起組成中間層，而外層則由碳酸鈣與蛋白質(zhì)組成[44]。其中甲殼素—蛋白纖維是由大約10～20個(gè)被蛋白質(zhì)包裹的甲殼素反平行鏈組成[45]。離子液體及含離子液體的多元體系具有溶解蛋白質(zhì)、甲殼素和灰分的能力[40,46]，所以甲殼素提取物中可能含有蛋白質(zhì)、碳酸鈣等雜質(zhì)。通常使用灰分測(cè)定法、凱氏定氮法、氨基酸分析法及元素分析法對(duì)甲殼素提取物的化學(xué)組成進(jìn)行分析鑒定[35,47-48]。

3.1 碳酸鈣的脫除率

蝦殼中礦物質(zhì)的含量是影響甲殼素溶解能力的重要因素[49]，蝦殼中的礦物質(zhì)主要是碳酸鈣，傳統(tǒng)酸法處理可有效去除蝦殼中的礦物質(zhì)成分，脫礦率高達(dá)90%以上[50-51]，如Younes等[50]報(bào)道的0.5 mol/L鹽酸對(duì)蝦殼的礦物質(zhì)脫除率達(dá)100%。離子液體主要通過(guò)陰、陽(yáng)離子與碳酸鈣的相互作用而實(shí)現(xiàn)蝦殼的脫礦過(guò)程。在反應(yīng)溫度100 ℃、時(shí)間1 h時(shí)，蝦殼經(jīng)過(guò)[Emim]Ac處理后礦物質(zhì)脫除率最高僅為42.84%[35]。而110 ℃溫度條件下，蝦殼在[DIPEA]P中反應(yīng)時(shí)間超過(guò)18 h后脫鈣率可達(dá)100%[38]。離子液體對(duì)蝦殼的脫礦效果的不同可能與離子液體種類、作用溫度和作用時(shí)間等多種因素有關(guān)。

3.2 蛋白質(zhì)的脫除率

蝦殼溶解過(guò)程中，離子液體的陰、陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)的氨基酸形成強(qiáng)的氫鍵作用，從而使甲殼素—蛋白纖維的氫鍵斷裂[52]。傳統(tǒng)脫蛋白常用堿法和酶法，脫除率可達(dá)90%以上[53-54]。當(dāng)反應(yīng)溫度120 ℃，時(shí)間8 h時(shí)，[Emim]Ac對(duì)蝦殼中蛋白質(zhì)脫除率為67.13%[35]。相較而言，銨基類離子液體([DIPEA]Ac、[DIPEA]P、[DMBA]Ac)處理30 h后提取的甲殼素中不含Ca元素，N元素<1.1%，具有良好的脫除礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的能力[38]。這可能與提取的時(shí)間有關(guān)，雖然甲殼素能夠在短時(shí)間內(nèi)溶解于[Emim]Ac等離子液體，但是當(dāng)蝦殼在離子液體中溶解時(shí)間越長(zhǎng)，越利于蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的脫除，提取的甲殼素純度越高。

4 再生后甲殼素提取物的結(jié)構(gòu)表征

通常采用掃描電鏡(SEM)、X-射線衍射(XRD)、紅外光譜分析(FT-IR)和熱重分析(TGA)等技術(shù)對(duì)再生后甲殼素提取物的表觀形貌、結(jié)晶度、分子結(jié)構(gòu)和熱性能進(jìn)行測(cè)定與鑒定[38,55-57]。

4.1 表觀形貌分析

市售甲殼素表面為一種粗糙而致密的層狀結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)酸堿法提取的甲殼素呈現(xiàn)多孔和纖維的表觀形貌[55]。根據(jù)報(bào)道[35,38]，利用離子液體從蝦殼中獲得的甲殼素提取物表面呈現(xiàn)魚(yú)鱗狀、多孔，而且出現(xiàn)黏附的絲狀纖維。而甲殼素直接在離子液體中溶解，再生甲殼素的表面不僅孔隙率增加，而且甲殼素樣品顆粒結(jié)構(gòu)也有所變化，如經(jīng)[Emim]Cl和[Bmim]Cl再生的甲殼素樣品的平均粒徑減小[27,56]。這些形貌的改變主要源于礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的脫除。

4.2 分子結(jié)構(gòu)表征

α-甲殼素在1 660，1 627 cm-1FTIR光譜處有明顯的兩個(gè)吸收帶，而β-甲殼素只在1 656 cm-1處有一條吸收帶[57]。周雅文等[37]發(fā)現(xiàn)蝦殼溶解再生物的紅外吸收在1 650，1 555 cm-1的酰胺振動(dòng)帶有明顯的吸收波長(zhǎng)。另外，Tolesa等[38]通過(guò)對(duì)比了市售甲殼素與離子液體提取的甲殼素的紅外吸收?qǐng)D譜，發(fā)現(xiàn)甲殼素提取物在1 660，1 560，1 312 cm-1處均有明顯的吸收波長(zhǎng)。說(shuō)明了利用離子液體提取的甲殼素含有酰胺基(—NHCOCH3)，具有與α-甲殼素類似的分子結(jié)構(gòu)。

4.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

Li等[58]指出經(jīng)離子液體預(yù)處理后，甲殼素的結(jié)晶度降低了25%。圖4為[Emim]Ac溶解處理前后蝦殼的XRD比較圖，與未處理蝦殼對(duì)比，經(jīng)過(guò)離子液體處理后的再生甲殼素結(jié)晶度最低可降至58.7%[35]。還有研究[38]指出，與市售甲殼素相比[DIPEA]Ac、[DIPEA]P和[DMBA]Ac提取蝦殼中的甲殼素結(jié)晶度分別降低55%，46%，45%。根據(jù)結(jié)構(gòu)圖的峰高和峰寬可直接判斷看出物質(zhì)的結(jié)晶度變化，與蝦殼原料相比，離子液體提取的甲殼素的結(jié)晶度下降，因?yàn)殡x子液體去除了蝦殼中的礦物質(zhì)[35,38]。

4.4 熱穩(wěn)定性分析

甲殼素的質(zhì)量損失通常分為兩步，第一步是甲殼素結(jié)構(gòu)中的水分蒸發(fā)，第二步是多糖環(huán)的脫水、甲殼素的乙?；兔撘阴；木酆蟍59-60]。Setoguchi等[43]研究結(jié)果表明利用離子液體提取的蟹殼中的甲殼素與市售甲殼素的TGA曲線幾乎一致。類似地，如圖5所示，Tolesa等[38]發(fā)現(xiàn)甲殼素的TGA曲線與市售甲殼素的TGA曲線基本吻合，說(shuō)明二者具有相似的熱穩(wěn)定性，有利于提取的甲殼素在抗熱材料中的應(yīng)用。對(duì)比圖4和圖5發(fā)現(xiàn)，離子液體提取的甲殼素結(jié)晶度的降低導(dǎo)致了甲殼素第二步質(zhì)量損失的起始溫度下降，說(shuō)明利用離子液體提取甲殼素會(huì)對(duì)其熱穩(wěn)定性有一定的影響。

圖4 [Emim]Ac溶解處理前后蝦殼XRD圖

圖5 再生甲殼素的TGA圖

5 展望

離子液體溶解蝦殼提取甲殼素的能力與傳統(tǒng)酸堿法相當(dāng)，可作為傳統(tǒng)酸堿試劑的良好替代品。近年來(lái)，利用離子液體提取蝦殼中甲殼素的研究不再局限于咪唑類離子液體，其他一些離子液體也逐漸被發(fā)掘。但是，離子液體黏度大的特點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了其與蝦殼之間的傳質(zhì)作用，降低了甲殼素的提取率。離子液體的低毒特性和昂貴的價(jià)格，也極大地限制了其使用。因此，在提高甲殼素提取率和純度的同時(shí)，可尋找一些其他試劑替代部分離子液體以降低其黏度和生產(chǎn)成本。另外，天然無(wú)毒離子液體的合成和加強(qiáng)離子液體循環(huán)利用是未來(lái)的研究需要進(jìn)一步關(guān)注的問(wèn)題。