鄭愛(ài)泉， 徐開(kāi)杰， 程亭亭， 張 超， 奚亞軍*， 孫風(fēng)麗*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所， 河南 安陽(yáng) 455000)

禾本科植物分蘗是分枝的一種特殊形式，是產(chǎn)量的重要因素之一。其形成包括分蘗芽的起始和伸長(zhǎng)兩個(gè)過(guò)程。研究分蘗芽伸長(zhǎng)的調(diào)控因素可以為生產(chǎn)中提高分蘗數(shù)目和生物產(chǎn)量提供指導(dǎo)。分蘗芽伸長(zhǎng)是非常復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，受到遺傳因素和環(huán)境因素共同調(diào)控，植物激素是遺傳調(diào)控和環(huán)境調(diào)控分蘗芽伸長(zhǎng)的直接調(diào)節(jié)物質(zhì)[1]。直接參與調(diào)控腋芽伸長(zhǎng)的內(nèi)源激素主要包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和獨(dú)腳金內(nèi)酯，其他激素如脫落酸、油菜素內(nèi)酯和赤霉素等也通過(guò)激素之間的相互作用參與其中。環(huán)境因素包括營(yíng)養(yǎng)成分(氮磷鉀等)、水分和光周期等，通過(guò)與不同激素的相互作用參與調(diào)控分蘗芽/腋芽伸長(zhǎng)[2-3]。

生長(zhǎng)素(3-吲哚乙酸，IAA)是研究最早的調(diào)控植物株型的植物激素之一。植物地上部分中，生長(zhǎng)素在主莖莖尖和幼嫩葉片內(nèi)合成，借助于PIN、AUX/LAX和MDR/PGP家族蛋白通過(guò)維管束向莖基部進(jìn)行極性運(yùn)輸，導(dǎo)致生長(zhǎng)素在植株不同部位梯度分布,啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)胚的發(fā)育、器官形成、側(cè)枝發(fā)育、側(cè)根產(chǎn)生、維管束發(fā)育及植物的向性等多方面具有重要作用[4-5]。細(xì)胞分裂素(Cytokinin,CTKs)對(duì)腋芽發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，可能作為生長(zhǎng)素的第二信使直接促進(jìn)腋芽的生長(zhǎng)[6]。CTK含量上升可導(dǎo)致植物在發(fā)育后期呈現(xiàn)高度分枝的表型[7]。獨(dú)腳金內(nèi)酯(Strigolactones,SLs)是最近被確認(rèn)的一種新的植物激素，它是一種產(chǎn)生于植物根部的類(lèi)胡蘿卜素衍生物，具有刺激寄生植物種子的萌發(fā)和促進(jìn)叢枝菌根真菌菌絲分枝的作用，可以沿莖干向上運(yùn)輸，與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素一起直接或間接抑制植物分枝[8]。獨(dú)腳金內(nèi)酯和生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等其他激素以及環(huán)境因素等存在相互作用共同調(diào)控腋芽的伸長(zhǎng)。其中獨(dú)腳金內(nèi)酯與生長(zhǎng)素的相互作用是目前研究較多的領(lǐng)域。獨(dú)腳金內(nèi)酯與生長(zhǎng)素在調(diào)控植物腋芽伸長(zhǎng)發(fā)育中存在密切、復(fù)雜的相互作用，擬南芥max突變體中生長(zhǎng)素對(duì)腋芽伸長(zhǎng)的抑制作用降低[9]；獨(dú)腳金內(nèi)酯可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸進(jìn)而影響生長(zhǎng)素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用[10]；生長(zhǎng)素參與調(diào)節(jié)SLs的合成[9,11-13]。生長(zhǎng)素和獨(dú)腳金內(nèi)酯相互作用非常復(fù)雜，存在其他激素、環(huán)境等調(diào)節(jié)因素的參與。環(huán)境因素中的營(yíng)養(yǎng)因素如氮(N)和磷(P)等影響植物腋芽的發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)氮和磷可能通過(guò)植物激素調(diào)節(jié)腋芽的發(fā)育，植物在低磷的環(huán)境下通過(guò)提高生長(zhǎng)素受體TIR1的表達(dá)增加對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性[14]；同時(shí)低磷低氮影響植物的SLs合成及運(yùn)輸[15-16]；生長(zhǎng)素和獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)途徑是氮調(diào)控植物分枝發(fā)育所必需的[17]。

柳枝稷是一種原產(chǎn)于美洲的多年生C4植物，適應(yīng)性強(qiáng)，生物量巨大，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，不占用作物耕地面積，是理想的能源作物之一[18-19]。能源作物年生物產(chǎn)量是重要的生產(chǎn)指標(biāo)，分蘗數(shù)目直接影響柳枝稷的生物產(chǎn)量。分蘗芽分化形成后是否伸長(zhǎng)決定了其是否發(fā)育成分蘗，柳枝稷分蘗芽的伸長(zhǎng)決定了柳枝稷的分蘗數(shù)目和生物產(chǎn)量。本研究對(duì)一個(gè)EMS誘變獲得的少分蘗突變體進(jìn)行生理、生化和分子生物學(xué)研究，探索柳枝稷分蘗伸長(zhǎng)調(diào)控的調(diào)控機(jī)理，為提高柳枝稷生物量提供分子基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

柳枝稷品種Alamo經(jīng)EMS(甲基磺酸乙酯)誘變所得少分蘗突變體lt，由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制保存，該突變體材料利用無(wú)性繁殖方式保存。生長(zhǎng)條件為光照16 h黑暗8 h、光照強(qiáng)度為12 000 lx。

瓜列當(dāng)種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)馬永清研究員課題組惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重力反應(yīng)測(cè)定 通過(guò)無(wú)性繁殖得到的兩突變體小苗，在溫室小盆中培養(yǎng)15天后，旋轉(zhuǎn)90度，每?jī)商鞙y(cè)量地上部分向上彎曲的角度。生長(zhǎng)素抑制劑處理選擇2,3,5-三碘苯甲酸溶解(TIBA)在丙酮中，隨后加入蒸餾水至終濃度為10 μM。每2天加一次相同丙酮含量的自來(lái)水作為對(duì)照。

1.2.2去頂處理 大田種植的柳枝稷生長(zhǎng)至主莖花序伸出時(shí)，去掉第一節(jié)，7天后測(cè)量腋芽伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度。

1.2.3激素測(cè)定 激素測(cè)定實(shí)驗(yàn)由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司測(cè)定，方法如下：

(1)激素提取

準(zhǔn)確稱(chēng)量約0.5 g新鮮植物樣品，于液氮中研磨至粉碎；向粉末中加入5 ml異丙醇/鹽酸提取緩沖液，4℃震蕩 30 min；加入 10 ml二氯甲烷，4℃震蕩 30 min；4℃，13 000 rpm離心5 min，取下層有機(jī)相；避光，以氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)相，以 400 μl甲醇(0.1%甲酸)溶解；過(guò) 0.22 μm濾膜，進(jìn)HPLC-MS/MS檢測(cè)。

(2)液質(zhì)檢測(cè)

用色譜柱(Poroshell 120 SB-C18反相色譜柱(2.1×150,2.7 um)；柱溫：30℃)吸附，流動(dòng)相：A:B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)；洗脫梯度：0～2 min，A=20 %；2～4 min，A遞增至50 %；4～10 min，A遞增至80 %；10～11 min，A=80%；11.1 min，A遞減至 20 %；11.1～15 min,A=20 %，進(jìn)樣體積為2 μl。質(zhì)譜條件：氣簾氣：15 psi；噴霧電壓：4 500 v；霧化氣壓力：65 psi；輔助氣壓力：70 psi；霧化溫度：400℃

1.2.4瓜列當(dāng)種子發(fā)芽 瓜列當(dāng)種子用10%次氯酸鈉溶液滅菌3 min，無(wú)菌水洗滌3～4次，用70%乙醇洗滌1 min，無(wú)菌水洗滌3～5次，超凈臺(tái)晾干后待用。將瓜列當(dāng)種子放置在加水的濾紙上在25℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3d。取柳枝稷根0.5 g用液氮研磨，加1 ml甲醇超聲處理30 min，離心取上清液。稀釋10倍后處理預(yù)培養(yǎng)的瓜列當(dāng)種子，3 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

表1 不同激素的檢測(cè)條件Table 1 Tests of different conditions of the corresponding hormones

1.2.5RNA提取、反轉(zhuǎn)錄與定量PCR 取新發(fā)出的柳枝稷分蘗使用Trizol方法進(jìn)行總RNA提取，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成。根據(jù)Primer 5.0設(shè)計(jì)定量PCR引物(表2)，按照熒光定量PCR試劑盒(Takara)使用說(shuō)明，使用ABI Q7定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用其指定的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 定量PCR引物列表Table 2 The primers used in qPCR

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 文中測(cè)量數(shù)據(jù)利用Excel 2010做圖表，利用LDS法對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 lt突變體分蘗能力減弱

與對(duì)照相比，lt突變體具有較弱的分蘗能力。突變當(dāng)代lt突變體可產(chǎn)生有2個(gè)分蘗而對(duì)照含有36個(gè)分蘗。柳枝稷是自交不親和植物，突變體采用無(wú)性繁殖。無(wú)性繁殖后代的第一代lt突變體和對(duì)照相比分蘗能力依然較弱(圖1)。

2.2 去頂后lt突變體腋芽伸長(zhǎng)速度減緩

柳枝稷莖節(jié)的腋芽一般處于休眠狀態(tài)，去掉莖尖頂端分生組織后，生長(zhǎng)素對(duì)莖節(jié)腋芽的抑制作用解除，腋芽開(kāi)始伸長(zhǎng)。lt突變體去頂后所有腋芽的伸長(zhǎng)速度與對(duì)照相比明顯降低(P<0.01)(圖2)。對(duì)照中從頂部向下的第一腋芽和第二腋芽的去頂后的伸長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異(P>0.05)，而lt突變體中第一腋芽伸長(zhǎng)速度明顯高于第二腋芽伸長(zhǎng)速度(P<0.05)(圖2)。這些結(jié)果表明lt突變體去頂后腋芽的伸長(zhǎng)速度受到抑制。

圖1 突變體lt分蘗能力下降Fig.1 The tillering ability of the lt mutant was decreased注：(A)和(B)分別為對(duì)照ht和突變體lt刈割第二代表型，Bar=10 cm；(C)分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照ht和lt突變體刈割后代的分蘗數(shù)；誤差線表示SEM；n=5. V0表示種子長(zhǎng)出的當(dāng)代；V1表示第一次刈割后長(zhǎng)出的后代Note:(A) The phenotype of V1 from ht and lt. Bars=10 cm. (B) Statistics tiller number of vegetable generations from ht and lt separately. Error bars represent SEM;n=5. V0 means the seedling grow from the isolated buds. V1 means the second generation after cutting

圖2 去頂后突變體lt腋芽伸長(zhǎng)受抑制Fig.2 The speed of axillary bud outgrowth in lt were inhibited after decapitation注：A去頂后腋芽的伸長(zhǎng)B統(tǒng)計(jì)結(jié)果，1、2、3代表腋芽的從上往下的順序Note:(A) Photograph of auxillary bud outgrowth in ht and lt after decapitation. (Left:ht;Right:lt) (B) Statistical analysis of length of auxillary bud outgrowth at different shoot nodes in ht and lt

2.3 lt突變體的重力反應(yīng)減弱

lt突變體地上部分的重力反應(yīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，lt突變體的重力反應(yīng)較對(duì)照弱(P<0.01)(圖3A)。用生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑TIBA處理，二者的重力反應(yīng)均變?nèi)?，但兩者之間的差異并未減少(P>0.05)(圖3B)。這些結(jié)果表明生長(zhǎng)素運(yùn)輸缺陷并不是導(dǎo)致lt突變體與對(duì)照向重力性反應(yīng)差異的主要因素。

圖3 ht和lt莖的向重力性Fig.3 Shoot gravitropism in switchgrass ht and lt注：A.重力刺激下ht和lt的表型(左：ht；右：lt)箭頭指向代表重力方向，標(biāo)尺為5厘米。B. 統(tǒng)計(jì)分析TIBA處理過(guò)和未處理過(guò)ht和lt莖的彎曲度.誤差線表示SEM，n=10，P<0.01 (ANOVA)Note:A.Photographs of ht and lt upon gravistimulation (left:ht;Right: lt) white arrow:direction of gravity. B.Statistical analysis of shoot curvature in ht and lt seedlings with or without TIBA treatment. Error bars represent SEM;n = 10,P<0.01 (ANOVA)

2.4 lt突變體中內(nèi)源植物激素IAA和ABA含量增加

為了研究促進(jìn)分蘗突變體形成的機(jī)制，用GC/MS方法測(cè)量了兩個(gè)突變體中赤霉素、脫落酸、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的含量。lt突變體中生長(zhǎng)素和脫落酸的含量相比對(duì)照明顯升高(P<0.05)，赤霉素和細(xì)胞分裂素的含量與對(duì)照無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)(圖4)。由此推測(cè)lt中分蘗芽生長(zhǎng)受抑制可能與生長(zhǎng)素和ABA的高含量有關(guān)。

2.5 lt突變體獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)含量增加

獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)最近被確定為激素抑制分枝[20-21]。SL可以刺激列當(dāng)種子萌發(fā)，植株根系提取物刺激列當(dāng)種子發(fā)芽可以間接反映獨(dú)腳金內(nèi)酯含量。結(jié)果表明lt突變體的根系提取物刺激列當(dāng)種子發(fā)芽率高于ht對(duì)照，推測(cè)lt突變體中獨(dú)腳金內(nèi)酯的含量高于對(duì)照，高含量的獨(dú)腳金內(nèi)酯導(dǎo)致lt的分蘗發(fā)育受到抑制(圖5 A-E)。

圖4 突變體lt的植物激素含量變化Fig.4 Hormone levels in ht and lt mutant注：誤差線表示± SDs；n = 3. *代表ht和lt之間存在差異顯著(P<0.05,ANOVA)，**代表ht和lt之間存在極顯著差異(P<0.05,ANOVA)。Note:Error bars represent means±SDs;n = 3. *There were a significant difference between ht and lt (P<0.05,ANOVA). **There were a highly significant difference between ht and lt(P<0.01,ANOVA)

獨(dú)腳金內(nèi)酯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因已經(jīng)較為明確，水稻中D10、D17和D27參與類(lèi)胡蘿合成SLs的過(guò)程，D14作為SLs的受體與D3、D53組成復(fù)合體，傳遞SLs的信號(hào)，對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響分蘗的發(fā)育。檢測(cè)ht和lt突變體中這些基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)D3、D10、D14、D17和D27等在lt突變體中高于ht對(duì)照(P<0.01)。SLs信號(hào)途徑的抑制子D53在lt突變體中表達(dá)水平略低于ht對(duì)照(P<0.05)(圖5 F)。結(jié)果表明，lt突變體中SLs的合成和信號(hào)相對(duì)于對(duì)照增強(qiáng)，獨(dú)腳金內(nèi)酯合成的增加是造成lt突變體分蘗數(shù)目減少的重要因素。

圖5 ht和lt中獨(dú)腳金內(nèi)酯含量分析及相關(guān)基因的檢測(cè)Fig.5 Analysis of strigolactones content and expression level of related genes in ht and lt mutant.注：A-E為不同物質(zhì)刺激瓜列當(dāng)種子萌發(fā)。A.水；B. GR24；C. ht根際分泌物；D. lt根際分泌物；E. 統(tǒng)計(jì)分析；誤差線表示± SDs；n=3。ht和lt呈極顯著差異(P<0.01,ANOVA). 標(biāo)尺為1 mm。F. 獨(dú)腳金內(nèi)酯途徑相關(guān)基因在ht和lt中的表達(dá)量變化(Actin基因?yàn)閮?nèi)參)。**代表差異極顯著(P<0.01);*代表差異顯著性(P<0.05)Note：A. Water;B. GR24;C. Combined root exudates from ht plant;D. Combined root exudates from the lt mutant;E. Statistical analysis of germination stimulation on O. aegyptiaca seeds. Error bars represent means±SDs;n=3. There were a significant difference between ht and lt (P<0.01,ANOVA). Bars=1 mm;F. Relative expression level of genes involved in SLs. The ACTIN gene was the reference gene. **There were a highly significant difference between ht and lt (P<0.01,ANOVA). *There were a significant difference between ht and lt (P<0.05,ANOVA)

3 討論

分蘗芽伸長(zhǎng)是由植物激素和環(huán)境之間的相互作用調(diào)控的，生長(zhǎng)素由枝條頂端分生組織產(chǎn)生，通過(guò)極性運(yùn)輸運(yùn)送到基部，抑制腋芽的生長(zhǎng)，而CK被向頂部運(yùn)輸，同時(shí)促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)，SLs同樣向頂運(yùn)輸，但抑制腋芽生長(zhǎng)[10]。ABA可以通過(guò)影響生長(zhǎng)素合成和運(yùn)輸來(lái)影響腋芽生長(zhǎng)[22]。這些植物激素通過(guò)形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控植物內(nèi)部生長(zhǎng)。柳枝稷的少分蘗突變體lt的獨(dú)腳金內(nèi)酯、ABA和生長(zhǎng)素含量均有所升高。定量PCR結(jié)果顯示參與SLs生物合成和信號(hào)途徑的基因表達(dá)水平存在差異。因此，柳枝稷分蘗芽的形成可能受上述植物激素的綜合調(diào)控。

水稻的SL信號(hào)途徑突變體能夠產(chǎn)生大量分蘗并且能夠增加突變體的向重力性反應(yīng)。SLs水平降低會(huì)導(dǎo)致較低一側(cè)的莖基部生長(zhǎng)素合成增加，從而增強(qiáng)了莖部的向重力性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，lt突變體中可能由于SLs的含量較高，導(dǎo)致SL信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)水平較高從而抑制分蘗芽的發(fā)育(圖5)。同時(shí)lt莖部的向重力反應(yīng)較弱(圖3)，可能是由于lt突變體的SLs水平升高導(dǎo)致較低一側(cè)的莖基部生長(zhǎng)素合成減少降低莖部的向重力性。但是lt中生長(zhǎng)素的含量增加(圖4)，lt突變體植株地上部分的向重力性反應(yīng)減弱可能是由于生長(zhǎng)素分布異常導(dǎo)致的，但是生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑TIBA處理后并不能減少lt與ht對(duì)重力響應(yīng)的差異，有待驗(yàn)證生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)的其他途徑。同時(shí)本研究中SLs含量檢測(cè)是用提取物刺激列當(dāng)種子發(fā)芽進(jìn)行間接測(cè)量的，需要更直接的方法檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步研究柳枝稷中SLs對(duì)分蘗的調(diào)控機(jī)制。

多年生禾本科植物柳枝稷能夠從位于莖節(jié)、根冠及根莖產(chǎn)生分蘗芽，在本研究中，突變體中分蘗芽的形成和伸長(zhǎng)均受到抑制。柳枝稷為自交不親和植物，所以試驗(yàn)中的突變體是種子通過(guò)EMS誘變產(chǎn)生后通過(guò)無(wú)性繁殖保存的，突變體與對(duì)照之間可能會(huì)有遺傳上的差異，即ht并不是嚴(yán)格意義的對(duì)照。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)突變體lt與對(duì)照ht之間的存在其他的差別，包括分蘗高度和莖稈直徑等方面，這可能是由于基因的一因多效造成的，也有可能是存在遺傳背景的差異，后期將在連續(xù)的生長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)突變體調(diào)控分蘗的特殊機(jī)制做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)柳枝稷少分蘗突變體lt進(jìn)行生理、生化和分子生物學(xué)研究，分析少分蘗突變體分蘗數(shù)目減少的原因。結(jié)果表明，突變體中的生長(zhǎng)素、脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯等植物激素含量的增加可能是其分蘗芽伸長(zhǎng)發(fā)育受抑制的重要因素。本研究可為生產(chǎn)中提高柳枝稷分蘗數(shù)增加生物產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)。