段晨暉，房彥軍，梁俊, 高志賢,#

1. 天津科技大學(xué)省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300457 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所, 天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300050

增塑劑可以提高塑料產(chǎn)品的透明性、可塑性和柔韌性，被廣泛應(yīng)用于塑料包裝的生產(chǎn)過程中[1]。近年來，增塑劑特別是鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，引起了不少食品安全事件。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)廣泛應(yīng)用于塑料快餐盒、生鮮食品保鮮膜及食品容器中，造成食品的污染[2]。另外，這類物質(zhì)非常容易散發(fā)到空氣中，難以降解，已成為全球性污染物。中國(guó)湖泊、江河中都普遍檢出了PAEs，最常見的是鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)。DBP和DEHP是長(zhǎng)江的主要污染物，濃度為35.65和54.73 μg·L-1，天津海河中也發(fā)現(xiàn)了最高濃度為41 μg·L-1的 DBP和101 μg·L-1的DEHP[3]。另外，在人體尿液和組織樣本中也檢測(cè)到了鄰苯二甲酸酯代謝物成分。Gao等[4]對(duì)中國(guó)新生兒母親群體進(jìn)行了PAEs的累積暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(CRA)，結(jié)果顯示，至少1.9%的新生兒母親的危險(xiǎn)指數(shù)(HI)大于安全閾值，這說明PAEs在人群中存在潛在的不良影響。大量的研究表明，PAEs能夠干擾人類和動(dòng)物一些激素調(diào)節(jié)的生理過程，改變內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)的正常功能，是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[5]。另外，這類物質(zhì)還具有一定程度的神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性和潛在的致癌作用。最近的一些研究結(jié)果表明，低分子量的PAEs如DEHP和DBP毒性相對(duì)較強(qiáng)，而高分子量的PAEs如鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)毒性相對(duì)較弱[6]。REACH是歐盟關(guān)于化學(xué)品及其安全使用的法規(guī)，一些低分子量的PAEs如DBP、鄰苯二甲酸丁基芐酯(benzyl butyl phthalate, BBP)、DEHP和鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate, DIBP)在REACH中被歸類為非常危險(xiǎn)的物質(zhì)。在動(dòng)物研究的基礎(chǔ)上，歐洲當(dāng)局將它們歸類為1B類，即被認(rèn)為對(duì)生殖有毒的物質(zhì)[7]。表1總結(jié)了幾種常見的PAEs的暴露水平[8-13]。

針對(duì)人體尤其是嬰幼兒長(zhǎng)期暴露于這些物質(zhì)造成的健康風(fēng)險(xiǎn)，有必要對(duì)其毒理效應(yīng)進(jìn)行全方位的評(píng)估。PAEs毒理學(xué)效應(yīng)研究的傳統(tǒng)方法主要是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即傳統(tǒng)的整體動(dòng)物毒性研究，雖然這種方法能夠?yàn)槎纠韺W(xué)研究提供全面而豐富的數(shù)據(jù)和資料，但其所需的費(fèi)用大、時(shí)間長(zhǎng)，所得的毒性結(jié)果往往是繼發(fā)性的或最后的綜合損傷。由于傳統(tǒng)體內(nèi)試驗(yàn)的諸多不便之處，更具針對(duì)性的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)開始越來越多地應(yīng)用在PAEs毒理學(xué)效應(yīng)的研究中。近年來，體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)由于其周期短、成本低和作用機(jī)制易于探明等優(yōu)勢(shì)得到快速的發(fā)展[14]，成為PAEs毒理學(xué)研究的主流方法。與傳統(tǒng)的動(dòng)物模型毒性評(píng)價(jià)相比，體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)具有高通量、低成本、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合針對(duì)特定作用位點(diǎn)進(jìn)行快速初篩，減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，提高了毒理學(xué)檢測(cè)的效率。本文從內(nèi)分泌干擾毒性、生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致癌作用幾個(gè)方面對(duì)PAEs的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行介紹，并簡(jiǎn)略概述了其基本原理。

表1 幾種常見的鄰苯二甲酸酯(PAEs)代謝物在人體內(nèi)的暴露水平Table 1 Exposure levels of several common phthalate esters (PAEs) metabolites in humans (ng·mL-1)

注：DEHP表示鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，mMP表示鄰苯二甲酸單甲酯，mEP表示鄰苯二甲酸單乙酯，mBP表示鄰苯二甲酸單丁酯，miBP表示鄰苯二甲酸單異丁酯，mECPP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羧基戊基)酯，mCMHP表示鄰苯二甲酸單[(2-羧甲基)己基]酯，mEHHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥基己基)酯，mEOHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-氧己基)酯，mEHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯，na表示數(shù)據(jù)不可得(尚未得到相關(guān)數(shù)據(jù))。
Note: DEHP stands for bis(2-ethylhexyl) phthalate; mMP stands for monomethyl phthalate; mEP stands for monoethyl phthalate; mBP stands for monobutyl phthalate; miBP stands for mono-2-isobutyl phthalate; mECPP stands for mono(2-ethyl-5-carboxypentyl) phthalate; mCMHP stands for mono-[(2-carboxymethyl)hexyl] phthalate; mEHHP stands for mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate; mEOHP stands for mono-(2-ethyl-5-oxohexyl) phthalate; mEHP stands for mono(2-ethylhexyl) phthalate; na stands for not available (data has not been obtained yet).

1 PAEs內(nèi)分泌干擾毒性的體外檢測(cè)(In vitro evaluation of endocrine disrupting effects of PAEs)

目前，常用的PAEs內(nèi)分泌干擾效應(yīng)體外檢測(cè)方法主要有2類：一類是核受體介導(dǎo)的報(bào)告基因方法，主要用來檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)與內(nèi)分泌功能相關(guān)的一些核受體的干擾作用；另一類是檢測(cè)目標(biāo)化合物對(duì)一些特定細(xì)胞激素合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的影響。這2類測(cè)試方法的作用原理和途徑各不相同，具有其各自的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用范圍。

1.1 核受體介導(dǎo)的報(bào)告基因方法

類固醇激素(包括雌激素、雄激素和孕激素等)，可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)受體結(jié)合成復(fù)合物，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，完成一系列復(fù)雜的生物學(xué)功能。這些受體是一類極其重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，稱為核受體超家族(nucleic receptor superfamily)[15]。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、雄激素受體(androgen receptor, AR)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)和維甲酸受體(retinoic acid receptor, RAR) 都是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可與激素或配體結(jié)合后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活靶基因轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，與生殖過程、新陳代謝調(diào)節(jié)和分化發(fā)育密切相關(guān)。

Engel等[16]運(yùn)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系ERα-HEK和ERβ-HEK進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定(luciferase reporter gene assay)，檢測(cè)了一些PAEs及其主要和次要代謝物對(duì)人類ERα或ERβ活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除了BBP以外的其他PAEs及其代謝產(chǎn)物均未增強(qiáng)ERα和ERβ的活性；而大部分PAEs對(duì)ERα和ERβ的活性具有抑制作用。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen[17]使用MVLN反式激活報(bào)告基因法測(cè)定了幾種PAEs對(duì)ER的誘導(dǎo)作用，在該測(cè)定中，只有BBP和DBP微弱增強(qiáng)了ER的活性，DEHP、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)未引起ER介導(dǎo)的反應(yīng)。沈歐璽[18]運(yùn)用核受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)方法(也稱為轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn))，研究了2種鄰苯二甲酸酯類增塑劑及其代謝物包括DEHP、DBP和鄰苯二甲酸單丁酯(monobutyl phthalate, MBP)對(duì)ER、AR和TR的干擾作用。研究結(jié)果表明，這3種物質(zhì)均具有抗雄激素活性和抗甲狀腺激素活性，無擬雌激素活性。Czernych等[19]使用雙酵母雜交技術(shù)(XenoScreen YES/YAS)研究了幾種PAEs的雌激素和雄激素活性，發(fā)現(xiàn)一些PAEs在較低的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗雌激素和抗雄激素效應(yīng)。

這類核受體介導(dǎo)的報(bào)告基因檢測(cè)方法普遍具有高通量、低成本和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但其局限性在于只能用來評(píng)價(jià)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)核受體的干擾作用。內(nèi)分泌系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜精密的系統(tǒng)，環(huán)境污染物不僅可以通過影響天然激素與受體結(jié)合的受體介導(dǎo)途徑發(fā)生作用，還可通過干擾激素合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等非受體介導(dǎo)途徑干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常運(yùn)作[20]。

1.2 非受體介導(dǎo)途徑的體外細(xì)胞模型

為了檢測(cè)一些環(huán)境污染物非受體介導(dǎo)途徑的內(nèi)分泌系統(tǒng)干擾作用，各種具備不同功能和特點(diǎn)的細(xì)胞模型也陸續(xù)被開發(fā)出來。

激素應(yīng)答小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞系(Hormone-responsive mouse Leydig MA-10 tumor cell line)是一種有效的激素應(yīng)答細(xì)胞模型，這種細(xì)胞能夠在人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)的作用下誘導(dǎo)孕酮的生成。Boisvert等[21]測(cè)試了DEHP的代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP)對(duì)MA-10細(xì)胞中孕酮合成的影響，結(jié)果顯示，濃度為10-4mol·L-1的MEHP顯著抑制了MA-10細(xì)胞孕酮的生成。H295R細(xì)胞系源于人腎上腺皮質(zhì)瘤，能表達(dá)類固醇激素合成過程中涉及的所有酶類，具有類似未分化的胚胎腎上腺細(xì)胞的生理特性，能生成腎上腺皮質(zhì)合成的所有類固醇激素，如孕激素、雄激素、雌激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素等，并與正常的人腎上腺細(xì)胞對(duì)毒物的反應(yīng)水平一致[22]，因此，H295R 細(xì)胞系成為體外篩選環(huán)境類固醇激素干擾物和研究其機(jī)制的最具潛力的工具。Harvey 等[23]指出 H295R 細(xì)胞系是一種有效的體外篩選環(huán)境類固醇激素干擾物的細(xì)胞模型。葉婷等[24]研究了DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP對(duì)H295R 細(xì)胞類固醇激素合成有關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEHP、MEHP均可影響H295R細(xì)胞類固醇激素合成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，并且MEHP 的影響更加明顯。Mankidy等[25]通過H295R類固醇生成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)暴露于10 mg·L-1的DEHP導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的雌二醇(E2)濃度增加4倍；暴露于10 mg·L-1的DEP導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的E2濃度增加2.3倍。除此之外，人胎盤絨毛膜癌(JEG-3)細(xì)胞系也是一種很有效的細(xì)胞模型，這種細(xì)胞能夠表達(dá)在發(fā)現(xiàn)于胎盤中的特定類固醇生成酶中，并具有非常高的芳香酶活性[26]。由CYP19編碼的胎盤芳香酶催化雄激素芳構(gòu)化為雌激素，它是雌激素生物合成中的關(guān)鍵酶，也是內(nèi)分泌干擾物靶向的關(guān)鍵終點(diǎn)[27]，這對(duì)于母體懷孕期間的健康非常重要。Perez-Albaladejo等[28]研究了一些PAEs對(duì)JEG-3細(xì)胞系P450芳香酶活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, BBP和DBP顯著降低了P450芳香酶的活性(IC50值大致為14 ～15 μmol·L-1)。綜上所述，一些PAEs在人和動(dòng)物體內(nèi)所造成的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)很有可能是通過干擾激素合成的途徑引起的。

2 PAEs胚胎發(fā)育毒性的體外檢測(cè)(In vitro detection of embryonic developmental toxicity of PAEs)

大量動(dòng)物研究表明，DEHP具有胚胎毒性，影響胚胎、胎兒發(fā)育。近20年來，隨著干細(xì)胞研究的日臻成熟，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)已成為發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的一種嶄新受試對(duì)象，能靈敏、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)有害物質(zhì)的毒性作用[29]。根據(jù)胚胎干細(xì)胞特性發(fā)展起來的胚胎干細(xì)胞模型，可用于評(píng)價(jià)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物潛在的胚胎毒性和致畸性。

崔棟等[30]建立了小鼠胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)DEHP的胚胎毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究結(jié)果表明，DEHP為弱胚胎毒性化合物。Yin等[31]使用小鼠胚胎干細(xì)胞評(píng)估了DEP和DBP的早期發(fā)育神經(jīng)毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度約為10 μmol·L-1時(shí)，DEP和DBP可以顯著改變神經(jīng)外胚層與神經(jīng)祖細(xì)胞形成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，這表明DEP與DBP具有潛在的神經(jīng)發(fā)育毒性。李玉秋等[32]分析了不同濃度的DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞活力與增殖的影響，研究發(fā)現(xiàn)隨著染毒劑量的增加(0.01～1 000 μmol·L-1)，DEHP、MEHP 對(duì)小鼠 ESC 活性的抑制作用增強(qiáng)，且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量(1 000 μmol·L-1)的DEHP和MEHP對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。

綜上所述，經(jīng)過許多研究者的驗(yàn)證，ESC已越來越多地應(yīng)用于化學(xué)品胚胎發(fā)育毒性的預(yù)測(cè)。胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test, EST)使用小鼠或人的胚胎干細(xì)胞來評(píng)估化學(xué)物潛在的胚胎發(fā)育毒性，非常適合于胚胎毒性評(píng)估。目前EST已經(jīng)被證明能夠在早期胚胎發(fā)育以及基因表達(dá)模式分化的時(shí)期指定細(xì)胞發(fā)育的流程[33]，從而得到不同功能的細(xì)胞類型，這種強(qiáng)大的分化潛力為化學(xué)物的毒理研究提供了豐富的實(shí)驗(yàn)素材。

3 PAEs神經(jīng)毒性的體外檢測(cè)(In vitro detection of neurotoxicity of PAEs)

近幾年，PAEs的神經(jīng)毒性開始受到人們的關(guān)注。PAEs具有脂溶性，易通過胎盤及血腦屏障進(jìn)入腦組織，影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[34]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，尿液中的DEHP代謝物MEHP的濃度可能與兒童的注意缺陷多動(dòng)癥有關(guān)[35]。此外，有人發(fā)現(xiàn)胚胎期暴露于DEHP可損傷嚙齒動(dòng)物的記憶行為，并認(rèn)為可能與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高以及誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[36]。目前，對(duì)于PAEs神經(jīng)毒性的體外評(píng)價(jià)主要是從待測(cè)細(xì)胞的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及增殖分化這幾個(gè)方面進(jìn)行。

PC 12 細(xì)胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，因其在神經(jīng)生長(zhǎng)因子刺激培養(yǎng)下表現(xiàn)出的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能皆類似于神經(jīng)細(xì)胞，因而在神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用[37]。朱才眾等[38]研究了低劑量的DBP對(duì)PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，不同劑量的DBP暴露對(duì)PC12細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且在低劑量慢性暴露條件下引起了PC12細(xì)胞的凋亡。同時(shí)DBP暴露還顯著降低了PC12細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物酶活性，造成了細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。Chen等[39]使用PC12細(xì)胞作為神經(jīng)發(fā)育模型來研究MEHP暴露對(duì)神經(jīng)元發(fā)育過程的影響，他們將未分化的PC12細(xì)胞暴露于MEHP中，研究其對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MEHP以劑量依賴性的方式抑制細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)了PC12細(xì)胞的膽堿能表型分化。這是MEHP通過影響細(xì)胞增殖和分化中的特定事件引發(fā)神經(jīng)發(fā)育毒性的第一次證明。除了PC12細(xì)胞，小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞也可作為研究神經(jīng)毒性的模型細(xì)胞。閔安娜等[40]研究了BBP對(duì)小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞的凋亡和氧化損傷水平的影響，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BBP染毒濃度≥5 g·L-1時(shí)，存活細(xì)胞減少，并且細(xì)胞界限不清，開始出現(xiàn)凋亡小體，這說明高濃度的 BBP 可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)并造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；而對(duì)染毒后細(xì)胞的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)以及還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定結(jié)果則表明BBP的暴露可以引起神經(jīng)瘤細(xì)胞的氧化損傷，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。

4 PAEs免疫毒性的體外檢測(cè)(In vitro detection of immunotoxicity of PAEs)

免疫毒性是指外源化學(xué)物通過損傷一些免疫細(xì)胞的形態(tài)和功能，干擾神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，使得機(jī)體免疫功能低下；或是通過影響免疫細(xì)胞的抗原識(shí)別能力和敏感性，導(dǎo)致過度的免疫應(yīng)答，從而引起超敏反應(yīng)或自身免疫性疾病。有關(guān)PAEs的免疫毒性，特別是其對(duì)免疫細(xì)胞的作用和介導(dǎo)超敏反應(yīng)的研究已經(jīng)有了一些進(jìn)展。Hoppin等[41]在美國(guó)全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查了人群尿液中的PAEs代謝產(chǎn)物含量并調(diào)查了人群過敏癥狀，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，DEHP和BBP的代謝產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)與哮喘、花粉熱和關(guān)節(jié)炎等疾病密切相關(guān)的19種特異性抗體的產(chǎn)生，這說明，PAEs的接觸暴露與一些超敏反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。Kruger等[42]研究發(fā)現(xiàn)，人角膜內(nèi)皮細(xì)胞B4G12暴露于DEHP后，炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-8和IL-16的分泌增加，其基因表達(dá)水平也有所升高。韓佳縈等[43]研究了DEHP對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫毒性作用，實(shí)驗(yàn)中采用了不同劑量的DEHP處理小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞因子分泌及活性氧水平的變化來評(píng)估DEHP暴露對(duì)免疫系統(tǒng)的毒性作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的DEHP處理可造成RAW264.7細(xì)胞的急性損傷，抑制了其細(xì)胞吞噬能力和細(xì)胞因子(TNF-α、IL-12和IL-23)的分泌能力，并且造成細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生。以上研究均表明，PAEs的暴露可從多方面影響免疫應(yīng)答，造成免疫毒性作用。

5 PAEs遺傳毒性的體外檢測(cè)(In vitro detection of genotoxicity of PAEs)

目前，已經(jīng)有許多體內(nèi)外的研究表明，PAEs暴露能夠造成染色體和DNA的損傷，引發(fā)遺傳毒性作用。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel electrophoresis, SCGE)又稱彗星實(shí)驗(yàn)，是一種廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)的技術(shù)，在檢測(cè)一些外源化學(xué)物對(duì)DNA的損傷方面有很高的靈敏性。Wang等[44]使用人胚胎腎細(xì)胞系(HEK-293)，通過單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)了DEHP誘導(dǎo)的DNA鏈斷裂，并通過檢測(cè)細(xì)胞中GSH含量的變化評(píng)估了氧化應(yīng)激在DNA損傷過程中的作用；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEHP能夠引起HEK-293細(xì)胞的DNA損傷，DEHP是通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)DNA鏈斷裂的，研究還發(fā)現(xiàn)，溶酶體和線粒體可能是DEHP誘導(dǎo)DNA損傷的重要靶點(diǎn)。細(xì)胞分裂阻滯微核測(cè)定(cytokinesis-block micronucleus, CBMN)也是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種試驗(yàn)方法。Molino等[45]運(yùn)用了彗星試驗(yàn)和微核測(cè)定2種方法評(píng)估了不同濃度的DEHP對(duì)歐洲鱸魚胚胎細(xì)胞系(DLEC)的遺傳毒性作用；彗星試驗(yàn)的結(jié)果表明，DLEC細(xì)胞DNA鏈斷裂的總量隨著DEHP濃度的增加而顯著增加；微核測(cè)定的結(jié)果表明，DEHP染毒濃度的增加引起了DLEC細(xì)胞微核率的顯著上升。以上研究都充分證明了PAEs潛在的遺傳毒性作用。

6 PAEs致癌作用的體外檢測(cè)(In vitro detection of carcinogenesis of PAEs)

PAEs潛在的致癌作用也是近年來學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。流行病學(xué)研究表明，PAEs暴露與人乳腺癌發(fā)病率呈正相關(guān)[46]。Crobeddu等[47]將乳腺癌上皮細(xì)胞T-47D暴露于接近環(huán)境劑量的DEHP和MEHP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明暴露于10 000 nmol·L-1的DEHP或0.1 nmol·L-1的MEHP可顯著促進(jìn)T-47D細(xì)胞的增殖，而不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該實(shí)驗(yàn)還表明，DEHP和MEHP可以通過激活孕酮受體(progesterone receptor, PR)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌上皮細(xì)胞的增殖，這可能增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Wu等[48]研究了BBP對(duì)ER(+)MCF-7乳腺癌細(xì)胞與ER(-)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BBP能夠顯著促進(jìn)這2種乳腺癌細(xì)胞的增殖，并加速其細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展至S期。同時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)還首次發(fā)現(xiàn)microRNA-19通過靶向PTEN 3’UTR(某種抑癌基因片段)，在BBP促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。Zhu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的PAEs (DEHP、DBP和BBP)能夠促進(jìn)PC-3和22RV1前列腺癌細(xì)胞的增殖，改變細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，并激活與癌癥細(xì)胞增殖密切相關(guān)的一些轉(zhuǎn)錄因子，這說明PAEs可能是前列腺癌的癌癥啟動(dòng)子。

7 總結(jié)及展望(Summary and prospects)

隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PAEs毒理作用研究的不斷深入，各種針對(duì)其內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致癌作用的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)模型開始得到廣泛的應(yīng)用(表2)。細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是從細(xì)胞類型的選擇、到評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定、進(jìn)而選擇適合的檢測(cè)方法的過程。在這一過程中，需要根據(jù)所測(cè)試的毒性效應(yīng)來選擇具有不同功能和特點(diǎn)的細(xì)胞模型，例如，在評(píng)價(jià)待測(cè)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)時(shí)被廣泛應(yīng)用的核受體介導(dǎo)的報(bào)告基因篩選細(xì)胞模型，用于胚胎發(fā)育毒性評(píng)價(jià)的ESC試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性作用的PC12細(xì)胞和神經(jīng)瘤細(xì)胞模型，以及用于免疫毒性檢測(cè)的巨噬細(xì)胞模型等。體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)具有周期短、成本低和機(jī)制易于探明等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)所需器材和原料的成本與動(dòng)物養(yǎng)殖相比較低廉，且不像動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)菢有枰罅康娜肆ν度?，相?duì)地易于操作和管理，節(jié)省人力物力。目前，PAEs體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的研究領(lǐng)域已經(jīng)從細(xì)胞水平上升到基因水平，通過數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序、熒光定量PCR(qRT-PCR)等分子生物學(xué)技術(shù)，能夠篩選出一些與細(xì)胞凋亡、增殖、代謝和分化等生理指標(biāo)密切相關(guān)的差異表達(dá)的基因，進(jìn)而揭示出PAEs不同毒性效應(yīng)的作用機(jī)制。

PAEs在環(huán)境中的濃度很低，大多數(shù)在機(jī)體中通過不斷蓄積或者幾種化學(xué)物共同作用，對(duì)生殖、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，嚴(yán)重影響機(jī)體健康[50]。而且PAEs是脂溶性物質(zhì)，這些物質(zhì)在環(huán)境中被動(dòng)物和人體接觸暴露后，一旦進(jìn)入體內(nèi)，便很快積蓄到脂肪組織里，不宜排泄出去，這可能導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)高濃度的PAEs殘留。由此可見，除了單一的體外細(xì)胞毒性研究，PAEs對(duì)人和動(dòng)物整體毒性作用的研究也是非常必要的。體外細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诙纠韺W(xué)評(píng)價(jià)的過程中雖然具有各種顯著的優(yōu)勢(shì)，但也有其不足之處。由于細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)只是體外單細(xì)胞水平上做出的毒性評(píng)估，沒有生物整體水平上的驗(yàn)證，缺乏生物體內(nèi)各細(xì)胞、組織和系統(tǒng)之間的相互聯(lián)系，因此無法準(zhǔn)確地得出PAEs在體內(nèi)環(huán)境下經(jīng)各系統(tǒng)作用后的整體毒性。因此，PAEs的體外毒性評(píng)價(jià)還需與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，或是盡可能地模擬體內(nèi)環(huán)境，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性。相信隨著新的技術(shù)和方法的不斷出現(xiàn)，以及國(guó)內(nèi)外學(xué)者的共同努力，PAEs毒理學(xué)效應(yīng)的研究將會(huì)邁向更高的水平。

表2 用于鄰苯二甲酸酯(PAEs)體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的細(xì)胞模型匯總Table 2 Summary of cell models for in vitro cytotoxicity evaluation of phthalate esters (PAEs)