王美淇，李遠(yuǎn)超，李文佳，陳 姍，孟 媛，劉晉宇，高 旭

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉133000)

淋巴細(xì)胞源于骨髓干細(xì)胞，后分化為B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，分別負(fù)責(zé)體液免疫和細(xì)胞免疫[1]。禽類B淋巴細(xì)胞在法氏囊內(nèi)分化成熟，而T淋巴細(xì)胞在胸腺中完成分化，B淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)體液免疫，T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫[1]。CD4與CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的兩個(gè)主要抗原受體，CD8淋巴細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，接受MHC I類分子遞呈的抗原，直接殺傷靶細(xì)胞清除外源病原體；CD4淋巴細(xì)胞又稱為輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，主要依賴分泌多種細(xì)胞因子來應(yīng)對(duì)外源抗原的侵襲，接受MHC II類分子遞呈的抗原[2]。CD4是一個(gè)單體蛋白，而CD8則由兩個(gè)不同蛋白組成，即α鏈和β鏈，經(jīng)二硫鍵連接形成αα二聚體和αβ二聚體，所以檢測(cè)CD8基因只需檢測(cè)α鏈基因[3-4]。

在人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)研究過程中發(fā)現(xiàn)，CD4與CD8淋巴細(xì)胞在抵御HIV過程中發(fā)揮著重要作用，機(jī)體免疫系統(tǒng)正常時(shí)CD4淋巴細(xì)胞占60%左右，CD8淋巴細(xì)胞占40%左右，當(dāng)發(fā)生病毒感染后，CD4淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD8淋巴細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，出現(xiàn)CD4與CD8淋巴細(xì)胞的比例失調(diào)，兩者比例動(dòng)態(tài)變化直接反應(yīng)病毒感染機(jī)體的嚴(yán)重程度和病程進(jìn)展，所以準(zhǔn)確定量檢測(cè)CD4與CD8淋巴細(xì)胞含量的動(dòng)態(tài)變化是判斷包括HIV等病毒性感染的關(guān)鍵指標(biāo)[5]。因此，建立一種能準(zhǔn)確定量檢測(cè)CD4與CD8基因的方法對(duì)病毒性疾病檢測(cè)非常必要。普通PCR和套式PCR只能定性檢測(cè)目的基因存在與否，且由于PCR后還需要瓊脂糖凝膠電泳等環(huán)節(jié)，操作繁瑣耗時(shí)，人為操作因素還會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。目前，未見有關(guān)延邊白鵝CD4和CD8淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法的報(bào)道。因此，本研究擬以延邊白鵝CD4與CD8α(簡(jiǎn)稱CD8)為目的基因，建立一種SYBR Green I熒光定量PCR方法，用于CD4與CD8轉(zhuǎn)錄水平的定量檢測(cè)，該方法不但可以定量，而且操作簡(jiǎn)單、省時(shí)和廉價(jià)，不需要電泳環(huán)節(jié)，可以通過機(jī)器直接判讀結(jié)果，將為CD4與CD8淋巴細(xì)胞的生物活性研究，以及延邊白鵝發(fā)生病毒性感染后細(xì)胞免疫水平和病程發(fā)展提供一種行之有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與目的基因 延邊白鵝由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)備用；延邊白鵝CD4、CD8、IFN-γ和IL-2基因由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒、ExTaq酶、pMD19-T載體、DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；刀豆素A(ConA)購自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒與膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；SBYR GreenⅠPCR Master Mix購自美國Promega公司；鵝外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒購自天津澋洋生物制品科技有限責(zé)任公司；基因組RNA提取試劑盒購自康為試劑生物科技有限公司。

1.3 引物的合成與設(shè)計(jì) 根據(jù)延邊白鵝CD4基因(KY034449)和CD8基因(KY034450)，以O(shè)ligo 6.0軟件在基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物：CD4-F：5'-CAGGATCACCTCCTTTCCCTCAACC-3'/CD4-R：5'-GGAGTTGTGTGGTACAGCAGCAAGC-3'，CD8-F：5'-GGAGATGCCACTGTCTGCAGAACTC-3'/CD8-R：5'-GAGCCCAGAGCCAGAAGTACGTGAC-3'。引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以延邊白鵝CD4基因和CD8基因?yàn)槟０?，利用設(shè)計(jì)的引物克隆目的基因后進(jìn)行TA克隆，利用膠回收試劑盒純化回收目的片段，分別連接至pMD19-T質(zhì)粒，構(gòu)建pMD19-CD4，pMD19-CD8重組質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件：CD4：94℃3 min；94℃30 s；57.9℃30 s；72℃30 s；72℃10 min，30個(gè)循環(huán)。CD8：94℃3 min；94℃30 s；58.7℃30 s；72℃30 s；72℃10 min，30個(gè)循環(huán)。將質(zhì)粒送英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，陽性質(zhì)粒作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化 在SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)總體積為20 μL不變的情況下，對(duì)引物濃度、模板、Reference Dye II和SYBR Premix ExTaqII酶等加入量進(jìn)行矩陣優(yōu)化；并對(duì)退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)和反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用常規(guī)方法將1.4中兩種質(zhì)粒分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，選擇菌液OD405nm值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0之間的兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋(101～108)后分別作為模板，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增，應(yīng)用7500 software v2.0.6進(jìn)行分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用已建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法，檢測(cè)延邊白鵝CD4、CD8、IFNγ和IL-2基因，同時(shí)設(shè)立延邊白鵝CD4或CD8基因陽性對(duì)照和水陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 以101～108共8個(gè)倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作模板，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，并同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，對(duì)二者結(jié)果進(jìn)行比較，分析該方法敏感性。常規(guī)PCR的引物、退火溫度與本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法一致。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 選取103、104、105倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR，分別進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，同時(shí)選擇不同時(shí)間提取的質(zhì)粒按照上述10倍倍比稀釋后作為模板，進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算各自變異系數(shù)并評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.10 鵝脾臟淋巴細(xì)胞的制備 無菌取鵝脾臟，用無鈣鎂離子PBS沖洗后，置于無菌9 cm平皿，將脾臟剪成碎沫，用60目細(xì)胞篩過濾，800 r/min離心8 min，利用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后再洗2次，重懸后緩慢加入鵝外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液液面上，1 000 r/min離心10 min，將乳白色細(xì)胞層吸出，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。

1.11 鵝脾臟淋巴細(xì)胞中CD4與CD8的檢測(cè) 鵝脾臟淋巴細(xì)胞孵育24 h后，分別加入60 μg/mL和120 μg/mL ConA繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并設(shè)立PBS對(duì)照，收集上清與細(xì)胞，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，按照已建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的延邊白鵝CD4基因和CD8基因?yàn)槟０澹迷O(shè)計(jì)的CD4-F/R和CD8-F/R引物PCR擴(kuò)增目的基因，結(jié)果顯示，克隆的部分CD4基因和CD8基因分別為121 bp和119 bp(圖略)，將其進(jìn)行TA克隆后測(cè)序，結(jié)果表明兩個(gè)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建正確，分別命名為pMD19-CD4和pMD19-CD8，經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算其濃度分別為1.2×109拷貝/μL和1.8×109拷貝/μL。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定SYBR Green I熒光定量PCR方法的最終反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaqII 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，cDNA模板3 μL，加DEPC處理水至25 μL。檢測(cè)CD4基因和CD8基因的最優(yōu)反應(yīng)條件均為：95℃10 min后，95℃30 s，58℃1 min，40個(gè)循環(huán)；之后再95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s。

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋(101～108)后，作為模板，并設(shè)立無菌水為陰性對(duì)照，進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均為0.999(圖1)，具有較好的擴(kuò)增效率，陰性對(duì)照無擴(kuò)增。

圖1 SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)CD4、CD8基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curves of CD4,CD8 gene by SYBR Green I real-time PCR

2.4 熒光定量PCR溶解曲線的建立 對(duì)不同稀釋度CD4和CD8質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行溶解溫度分析。結(jié)果顯示，不同的CD4和CD8質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品溶解溫度分別為80.5℃和81.6℃，波峰與標(biāo)準(zhǔn)品濃度成正相關(guān)，且融解曲線均為單峰(圖2)。表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一產(chǎn)物。

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)已建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法，檢測(cè)延邊白鵝CD4、CD8、IFNγ和IL-2基因，結(jié)果顯示，僅延邊白鵝CD4和CD8基因?yàn)殛栃裕渌舆叞座Z的細(xì)胞免疫因子基因均為陰性(圖3)。表明本研究建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)CD4和CD8基因的溶解曲線Fig.2 The dissolution curves of CD4 and CD8 genes by SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

圖3 SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)CD4和CD8基因的特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity analysis of the detection of CD4 and CD8 genes

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 由CD4和CD8的SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增圖譜顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均可被檢測(cè)到的最小稀釋倍數(shù)為108(圖4)，較普通PCR檢測(cè)濃度提高100倍(圖5)，表明本試驗(yàn)建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法具有較高的敏感性。

圖4 SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)CD4、CD8基因的擴(kuò)增曲線Fig.4 The amplification curves of CD4,CD8 gene by SYBR Green I real-time PCR

圖5 普通PCR檢測(cè)CD4和CD8的敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensitivity of normal PCR to detect CD4 and CD8 gene

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)不同稀釋度的CD4和CD8標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)與組間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增CD4基因的熒光定量PCR方法組內(nèi)變異系數(shù)為0.8%～1.1%，組間變異系數(shù)為1.3%～1.7%；CD8組內(nèi)變異系數(shù)為0.7%～1.0%，組間變異系數(shù)為1.1%～1.3%(表1、表2)，變異系數(shù)均小于2%。表明所建立SYBR Green I熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性。

表1 CD4熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 The repeatability assay of CD4 real-time PCR

表2 CD8熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 The repeatability assay of CD8 real-time PCR

2.8 鵝脾臟淋巴細(xì)胞CD4與CD8基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果 采用已建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法對(duì)ConA刺激鵝脾臟淋巴細(xì)胞24 h后CD4與CD8基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，60 μg/mL和120 μg/mL的ConA刺激鵝脾臟細(xì)胞后，CD4與CD8基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于PBS對(duì)照組(p<0.05)，而兩個(gè)劑量ConA刺激組之間差異不顯著(p>0.05)。ConA可以激活鵝脾臟淋巴細(xì)胞CD4和CD8基因的轉(zhuǎn)錄水平。表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法可以用于鵝CD4、CD8轉(zhuǎn)錄水平定量檢測(cè)。

3 討論

禽類與哺乳動(dòng)物的T淋巴細(xì)胞均具有相同功能，可介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答[6-7]。其中CD4與CD8分子在動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮著重要做用，兩者比例失衡反映機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生異常，或受到外源病原體侵入，檢測(cè)CD4與CD8分子在機(jī)體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化是評(píng)價(jià)某些傳染病病程和病原體復(fù)制情況的重要指標(biāo)。

在體外研究CD4與CD8分子需要借助能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化的刺激原，ConA就是一種常用的有絲分裂原，其可以在體外刺激胸腺、脾臟等免疫細(xì)胞大量增殖，尤其對(duì)T淋巴細(xì)胞有激發(fā)作用，可以滿足相關(guān)研究對(duì)免疫細(xì)胞的需要[8-10]。本研究未采用鵝胸腺細(xì)胞作為獲得T淋巴細(xì)胞的組織源，因?yàn)殡r鵝的胸腺過小，嘗試多次仍滿足不了T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而成年鵝胸腺出現(xiàn)萎縮，無法從成年鵝獲取足夠量胸腺組織進(jìn)行后期SYBR Green I熒光定量PCR方法的應(yīng)用試驗(yàn)。因此，本研究選取成年鵝的脾臟作為目的臟器，經(jīng)剪碎和濾篩過濾后采用人淋巴細(xì)胞分離液Histopaque-1077分離鵝T淋巴細(xì)胞，所獲得的淋巴細(xì)胞較少，沒有達(dá)到試驗(yàn)要求，最終通過鵝外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒，獲得了較好效果。通過Con A誘導(dǎo)，使培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞CD4與CD8得到轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)顯示60 μg/mL和120 μg/mL的ConA誘導(dǎo)組之間CD4與CD8轉(zhuǎn)錄水平差異不顯著(p>0.05)，提示在此劑量范圍內(nèi)，ConA劑量與CD4與CD8轉(zhuǎn)錄水平不存在明顯的正相關(guān)性，表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法可用于臨床檢測(cè)。

目前，用于基因定量檢測(cè)的方法主要有染料熒光定量PCR和探針熒光定量PCR，探針熒光定量PCR方法雖然可以實(shí)現(xiàn)完全定量，但存在方法難建立、費(fèi)用昂貴、操作要求高等缺點(diǎn)[11]。染料熒光定量PCR方法相對(duì)操作簡(jiǎn)單，所需費(fèi)用較低，與探針相比唯一缺點(diǎn)是不能完全定量，只能相對(duì)定量，但完全滿足檢測(cè)CD4與CD8的動(dòng)態(tài)比例要求[12]。在眾多染料中，SYBR Green I是最常用、最穩(wěn)定的一種染料，本研究采用SYBR Green I作為熒光染料，具有環(huán)保安全、熒光信號(hào)強(qiáng)和背景信號(hào)低等優(yōu)點(diǎn)，在反應(yīng)體系中加入了ROX reference Dye均一化參比染料，避免了反應(yīng)體系內(nèi)出現(xiàn)泡沫、蒸發(fā)和冷凝等導(dǎo)致不同批次間出現(xiàn)差異，建立方法特異性和敏感性良好，組間與組內(nèi)變異系數(shù)均小于2%，具有很好的重復(fù)性，確保試驗(yàn)結(jié)果均一。

本研究建立了檢測(cè)延邊白鵝CD4與CD8基因的SYBR Green I熒光定量PCR方法，該方法快捷、簡(jiǎn)單，可以用于定量檢測(cè)鵝CD4與CD8分子的轉(zhuǎn)錄水平和動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步研究鵝細(xì)胞免疫水平和CD4、CD8生物活性奠定了基礎(chǔ)。