張遠(yuǎn)星，李統(tǒng)戰(zhàn)，余子豪，查 帆，李倩文，余旭平

(浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058)

細(xì)菌性疫病嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展，也威脅著人類健康，殺死或抑制細(xì)菌生長是控制細(xì)菌性疫病的主要手段，但隨著抗生素和抗菌藥物的廣泛使用特別是濫用，細(xì)菌耐藥性問題變得越來越突出和嚴(yán)重，尋找新的藥物和解決方法成了剛需。人們嘗試探索應(yīng)用抗菌肽、微生態(tài)制劑、甚至噬菌體等來解決耐藥性問題。1980年瑞典科學(xué)家在研究北美天蠶的免疫機(jī)制時(shí)，將細(xì)菌注入滯育蛹后發(fā)現(xiàn)血淋巴中產(chǎn)生了具抑菌作用的多肽類物質(zhì)，由此發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)動(dòng)物源抗菌肽天蠶素[1]。此外，研究人員還從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動(dòng)物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得多種具有抗菌活性的多肽[2-3]。

噬菌體也用于治療人類、動(dòng)物的細(xì)菌性疾病[4-5]。噬菌體按子代釋放方式可分為絲狀噬菌體和裂解噬菌體。用于治療的噬菌體為裂解噬菌體，按裂解因子組份它們可進(jìn)一步分為單裂解肽噬菌體和雙組份裂解噬菌體。前者通過單一裂解肽插入細(xì)胞膜并損害細(xì)胞壁來裂解細(xì)菌；后者表達(dá)裂解酶(Virolysin)和穿孔素(Holin)兩個(gè)組份，其中穿孔素在細(xì)胞膜上形成孔洞，協(xié)助裂解酶分泌到周間質(zhì)，水解細(xì)胞壁肽聚糖，裂解細(xì)菌[5]。然而，噬菌體治療具有局限性，存在抗菌譜窄、易被免疫系統(tǒng)快速清除等問題[6]，人工表達(dá)或直接應(yīng)用這些產(chǎn)物或許可以減輕和解決上述問題，應(yīng)用重組的雙組份噬菌體裂解酶進(jìn)行動(dòng)物耐藥菌的防治目前已有報(bào)道[7]。

單裂解肽噬菌體包括DNA噬菌體φX174以及RNA噬菌體M和Qβ等，它們表達(dá)的裂解肽分子量比裂解酶小，而且一些裂解肽具有類似抗菌肽的結(jié)構(gòu)，包括含有一段疏水肽段及帶較多正電荷氨基酸殘基，并且采用同樣的破壞細(xì)胞膜方式裂解細(xì)菌[8]。噬菌體φX174、M和Qβ均感染大腸桿菌，其中φX174裂解肽E和噬菌體M裂解肽M-lysis的結(jié)構(gòu)和大小與抗菌肽類似，而Qβ噬菌體編碼的裂解肽A2無疏水跨膜區(qū)，不同于抗菌肽[8-9]。Yu等發(fā)現(xiàn)表達(dá)裂解肽E衍生物mE對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有更好的溶菌效果[10]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇和人工合成了φX174的E及其衍生mE基因和噬菌體M的裂解基因M-lysis，克隆于pN15E6高效表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化配套宿主菌DH31soplacI和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)菌株JM109，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，觀察并比較這3種噬菌體裂解肽致死這兩種大腸桿菌宿主的程度，探索它們成為“抗菌肽”的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；快速抽提型質(zhì)粒DNA小量試劑盒、快速抽提型基因組DNA小量試劑盒均購自愛思進(jìn)生物公司；T4 DNA連接酶購自New England BioLabs公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Chl)、甘油均購自生工生物工程(上海)有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母浸出粉購自O(shè)xoid公司。

1.2 質(zhì)粒與菌株 pN15E6質(zhì)粒及其宿主菌DH31soplacI由俄羅斯科學(xué)院Ravin惠贈(zèng)[11]；DH31soplacI菌株是pN15E6質(zhì)粒的配套菌株，包含lacIq基因并具有氯霉素抗性；JM109菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 參照文獻(xiàn)合成M-lysis[9]、mE、E[10]3個(gè)基因。分別對(duì)應(yīng)于噬菌體M(NC_019707)序列的2 991 bp～3 104 bp位置(M-lysis)和噬菌體φX174(NC_001422)序列的643 bp～843 bp和568 bp～843 bp位置(mE和E基因)，設(shè)計(jì)合成引物，通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)[12]合成對(duì)應(yīng)的3個(gè)基因。為獲得較好的表達(dá)效率，本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。結(jié)合載體酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增M-lysis、mE、E基因片段，亞克隆至pN15E6表達(dá)載體。參照pN15E6載體序列，設(shè)計(jì)用于鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒的引物。具體引物名稱、擴(kuò)增片段長度以及序列見表1，引物合成由華大生物科技有限公司完成。

1.4 目的基因的合成與測序鑒定 應(yīng)用SOE-PCR方法將引物M_lysis12_Bgl、M lysis2-4、M lysis3bb和M lysis4bbNco混合，經(jīng)SOE-PCR合成M-lysis基因；將引物mE1Bgl1、mE-2、mE-3、mE-4、mE-5、mE6和mE-7NcoA'混合，應(yīng)用SOE-PCR合成mE基因；將mE-7NcoA'更換成E-7+v，并進(jìn)一步加入E-8v、E-9vT引物，經(jīng)SOE-PCR合成E基因。將SOE-PCR合成的3個(gè)基因片段分別克隆于pMD18-T載體，PCR鑒定陽性質(zhì)粒送華大基因公司測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pMD_Mlysis、pMD_mE和pMD_E。

表1 目的基因合成、片段擴(kuò)增對(duì)應(yīng)引物Table 1 Primers for synthesis and amplification of target genes

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以M_lysis12_Bgl和M lysis4bbNco、mE-1Bgl1和mE-7NcoA'、mE-1Bgls和E-9vTNcoAs為引物，應(yīng)用PCR分別以pMD_Mlysis、pMD_mE和pMD_E質(zhì)粒為模板擴(kuò)增M-lysis、mE、E基因，將回收的基因片段與pN15E6質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ/BglⅡ雙酶切，酶切的基因片段分別與質(zhì)粒pN15E6連接后轉(zhuǎn)化JM109，以pN15-insChKUp3和pN15-insChKDn2為引物進(jìn)行PCR鑒定，陽性質(zhì)粒由華大基因公司測序，確認(rèn)序列的正確性。正確的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E。

1.6 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)JM109菌株和DH31soplacI菌株的致死性測定 將pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E分別轉(zhuǎn)化至JM109和DH31soplacI感受態(tài)細(xì)胞，將得到的重組菌過夜培養(yǎng)后稀釋106倍(約1.0×103個(gè)細(xì)菌/mL)，分別涂布于含和不含IPTG誘導(dǎo)劑的Kan+LB平板或Chl+Kan+LB平板培養(yǎng)基上，將平板置37℃過夜培養(yǎng)，觀察細(xì)菌菌落生長。

1.7 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)DH31soplacI菌株的致死效率測定 將含pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E質(zhì)粒的DH31soplacI重組菌過夜培養(yǎng)物分別稀釋103倍(約1.0×106個(gè)細(xì)菌/mL)，分別涂布于含IPTG誘導(dǎo)劑的Chl+Kan+LB平板培養(yǎng)基上，同時(shí)將稀釋106倍(約1.0×103個(gè)細(xì)菌/mL)的過夜培養(yǎng)物分別涂布于不含IPTG誘導(dǎo)劑的Chl+Kan+LB平板上，將平板置于37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算過表達(dá)M-lysis、mE和E基因?qū)Υ竽c桿菌的致死效率。

1.8 各基因過表達(dá)重組菌的生長曲線測定 將pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E分別轉(zhuǎn)化DH31soplacI感受態(tài)細(xì)胞，將獲得的各重組菌震蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5后加IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導(dǎo)，每隔30 min測定OD600nm值；以不加IPTG誘導(dǎo)劑為對(duì)照，同時(shí)培養(yǎng)，同樣時(shí)間點(diǎn)測定OD600nm值，將測定值繪制生長曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的合成與測序鑒定 應(yīng)用SOE-PCR經(jīng)引物重疊延伸，合成M-lysis、mE和E基因。PCR合成產(chǎn)物均出現(xiàn)一條明顯的與目標(biāo)大小相符的目的條帶，但目的條帶前后存在較明顯的拖尾現(xiàn)象。將SOE-PCR合成的3個(gè)基因片段回收后分別克隆于pMD18-T載體，用PCR篩選到插入片段長度正確的目標(biāo)質(zhì)粒。以pMD_Mlysis、pMD_mE和pMD_E為模板，PCR擴(kuò)增相應(yīng)的插入片段，結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的基因片段大小分別約為100 bp、200 bp、300 bp，與各自預(yù)期目的基因相符(圖1)。相應(yīng)重組質(zhì)粒進(jìn)一步測序結(jié)果顯示與預(yù)期一致。表明正確合成了M-lysis、mE和E基因。

圖1 重組質(zhì)粒中M-lysis、mE、E基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of M-lysis,mE and Egenes from recombinant plasmids by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 應(yīng)用PCR從pMD_Mlysis、pMD_mE和pMD_E質(zhì)粒中擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，亞克隆于pN15E6表達(dá)質(zhì)粒，獲得目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒。以pN15-insChKUp3和pN15-insChKDn2為引物，對(duì)目標(biāo)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，從pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E質(zhì)粒分別擴(kuò)增得到370 bp、456 bp和532 bp的基因片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。相應(yīng)重組質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)一步測序顯示，已獲得正確的重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE和pN15E6-E的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant pN15E6-M-lysis,pN15E6-mE and pN15E6-E plasmids by PCR

2.3 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)JM109菌株的致死性測定 將各基因重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)稀釋后涂布于含和不含IPTG誘導(dǎo)劑的Kan+LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在不含IPTG誘導(dǎo)劑的平板上各重組菌生長良好(圖3)，與之比較，在含IPTG的平板上，pN15E6-M-lysis/JM109重組菌菌落形態(tài)變小，但仍有少量與原始菌大小一致的耐受菌(圖3A)，表明絕大部分細(xì)菌生長受到過表達(dá)M-lysis基因的抑制，個(gè)別細(xì)菌具有耐受性。pN15E6-mE/JM109重組菌菌落形態(tài)變小且數(shù)量減少(圖3B)，表明部分重組菌被過表達(dá)的mE基因所殺滅，有部分菌仍存活，但生長受到抑制。而pN15E6-E/JM109重組菌在含IPTG的平板上菌落數(shù)目明顯減少，僅有少量耐受菌生長(圖3C)，表明過表達(dá)E基因殺滅了大部分細(xì)菌，但仍有少量耐受菌存活。

圖3 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)大腸桿菌JM109菌株的致死性測定Fig.3 Analysis of lethality to Escherichia coliJM109 strains whenM-lysis,mE and Egenes were over-expressed respectively

2.4 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)DH31soplacI菌株的致死性測定 將3種DH31soplacI重組菌過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別稀釋106倍，涂布于含和不含IPTG誘導(dǎo)劑的Chl+Kan+LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示在不含IPTG誘導(dǎo)劑的平板上重組菌生長狀態(tài)均良好(圖4)，與之比較，在含IPTG的平板上的含pN15E6-M-lysis和pN15E6-mE的重組菌數(shù)量明顯減少，但有少量菌耐受(圖4A、4B)，而含pN15E6-E質(zhì)粒的重組菌在含IPTG的平板上則無菌落生長(圖4C)。表明E基因過表達(dá)致死作用最強(qiáng)。

圖4 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)大腸桿菌DH31soplacI菌株的致死性測定Fig.4 Analysis of lethality to Escherichia coliDH31soplacI strain when M-lysis,mE and Egenes were over-expressed respectively

2.5 M-lysis、mE、E基因過表達(dá)對(duì)DH31soplacI菌株的致死率測定 將3種DH31soplacI重組菌過夜培養(yǎng)物分別稀釋103倍，涂布于含IPTG誘導(dǎo)劑的Chl+Kan+LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)；同時(shí)稀釋106倍涂布于不含IPTG誘導(dǎo)劑的Chl+Kan+LB固態(tài)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)；最后結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算過表達(dá)相應(yīng)基因的致死效率。結(jié)果顯示，過表達(dá)M-lysis、mE、E基因?qū)H31soplacI菌株的致死率分別為99.03%、99.68%、99.9998%(表2)。進(jìn)一步表明E基因過表達(dá)對(duì)細(xì)菌的致死作用最強(qiáng)。

表2 M-lysis、mE和E基因過表達(dá)對(duì)DH31soplacI菌株的致死效率測定Table 2 Quantification of the lethality of M-lysis,mE and Egenes over-expressed in DH31soplacI strain

2.6 各基因過表達(dá)重組菌的生長曲線測定 將轉(zhuǎn)化pN15E6-M-lysis、pN15E6-mE、pN15E6-E質(zhì)粒的DH31soplacI重組菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后定時(shí)測定其OD600nm值，繪制曲線圖，結(jié)果顯示，E基因過表達(dá)后重組菌OD600nm值明顯下降；M-lysis和mE基因過表達(dá)后重組菌OD600nm值與對(duì)照相比略有下降(圖5)。表明E基因過表達(dá)能夠迅速致死并裂解細(xì)菌，而M-lysis和mE基因過表達(dá)裂解細(xì)菌能力較弱。

圖5 DH31soplacI過表達(dá)重組菌的生長曲線圖Fig.5 The growth curves of E.coliDH31soplacI strains when M-lysis,mEandEgenes were over-expressed respectively

3 討論

一些噬菌體在生長后期通過調(diào)控表達(dá)裂解酶和裂解肽在細(xì)胞膜上形成孔洞，裂解細(xì)菌并釋放子代噬菌體。T4、T7、λ等噬菌體裂解細(xì)菌需要穿孔素和裂解酶兩種組分，而φX174、M、MS2等噬菌體僅需要單一的裂解肽。其中φX174噬菌體的裂解肽E和mE以及M噬菌體的裂解肽M-lysis，均包含疏水區(qū)段及較高比例的精氨酸和賴氨酸，長度分別為91、66和37個(gè)氨基酸，其大小和結(jié)構(gòu)與抗菌肽(AMPs)相當(dāng)。有報(bào)道應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌性疾病，但噬菌體治療存在抗菌譜窄、易被免疫系統(tǒng)快速清除等問題[6]?？咕淖鳛樾滦涂咕幬铮灰桩a(chǎn)生耐藥性，可以彌補(bǔ)噬菌體藥物治療的不足并緩解傳統(tǒng)抗生素耐藥性問題?？咕氖窃撕驼婧松镏邢忍烀庖叻烙到y(tǒng)的多功能組分，其長度通常少于100個(gè)氨基酸，一些甚至在50個(gè)氨基酸以內(nèi)[13]。抗菌肽主要通過與細(xì)胞膜結(jié)合改變膜通透性而起作用，絕大部分抗菌肽含有疏水肽段，并帶正電荷[14]。因此，本研究嘗試表達(dá)大小和結(jié)構(gòu)與抗菌肽相當(dāng)、功能與抗菌肽相似的噬菌體裂解肽基因M-lysis、E和mE，測定其致死宿主細(xì)菌的能力，為探索開發(fā)噬菌體來源的“抗菌肽”奠定基礎(chǔ)。

本研究將噬菌體φX174的E基因及其衍生mE基因和噬菌體M的裂解基因M-lysis克隆至高效表達(dá)載體pN15E6上，誘導(dǎo)過表達(dá)，觀察其對(duì)宿主大腸桿菌JM109菌株和DH31soplacI菌株的致死作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)3種噬菌體基因?qū)H31soplacI菌株的致死作用比對(duì)JM109菌株的致死作用強(qiáng)。DH31soplacI菌株由DH10B菌株整合入pCD11-31soplacI質(zhì)粒構(gòu)建而成，因此DH31soplacI菌株染色體中整合了PBAD啟動(dòng)子控制下的antA基因，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可提高pN15E6表達(dá)載體拷貝數(shù)，加強(qiáng)外源基因的表達(dá)[11]，而JM109菌株沒有該結(jié)構(gòu)，這可能是造成對(duì)二者致死差異的原因，當(dāng)然，不同實(shí)驗(yàn)菌株間的差異本身可能也是造成這種差異的原因。本研究首次發(fā)現(xiàn)，M-lysis、E以及mE基因過表達(dá)后對(duì)宿主JM109菌株和宿主DH31soplacI菌株影響效果不同，而二者同為大腸桿菌，推測過表達(dá)產(chǎn)生致死作用的原因可能存在差異。

本研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)E基因的致死作用最強(qiáng)，生長曲線測定結(jié)果也顯示過表達(dá)E基因能迅速致死和裂解細(xì)菌。mE基因是E基因起始密碼ATG缺失單堿基A的結(jié)果，正由于少了這個(gè)堿基導(dǎo)致起始密碼子缺失，最前面的25個(gè)密碼子編碼序列變成了74 bp的非編碼區(qū)，原來編碼的91個(gè)氨基酸的E裂解肽縮短為66個(gè)氨基酸的mE[10]。有研究認(rèn)為裂解肽E的N末端前51個(gè)氨基酸是裂解活性所必需的[15]，裂解活性定位N末端前29個(gè)氨基酸[16]，也有研究認(rèn)為，N末端前35個(gè)氨基酸多肽是裂解活性所必需的，它包含一段疏水序列，在裂解的過程中可能起到跨膜作用[17]。Yu等發(fā)現(xiàn)，表達(dá)N末端缺失25密碼子的裂解基因E(即mE)對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有更好的溶菌效果[10]。本研究結(jié)果顯示，盡管缺失25密碼子的mE基因過表達(dá)具有裂解活性，但mE對(duì)大腸桿菌DH31soplacI致死作用不如全長的E。這個(gè)結(jié)果差異有可能是由于第一個(gè)起始密碼子缺失有利于mE基因表達(dá)造成的，也有可能是由于合成基因?qū)γ艽a子進(jìn)行了優(yōu)化，導(dǎo)致表達(dá)效率發(fā)生變化的結(jié)果，但結(jié)合以往對(duì)活性區(qū)域的研究結(jié)果[15-16]，推測N末端缺失25個(gè)氨基酸影響到殺菌功能的可能性比較大。

本研究比較了3種噬菌體裂解基因M-lysis、mE和E對(duì)大腸桿菌的致死效果，其中過表達(dá)φX174噬菌體的E基因致死效果最好，這為進(jìn)一步開發(fā)噬菌體裂解肽奠定基礎(chǔ)。相對(duì)于真核生物，對(duì)細(xì)菌致死機(jī)制的許多方面有待進(jìn)一步探索、研究和完善。本研究的噬菌體裂解肽是通過直接裂解細(xì)菌而發(fā)揮致死作用，這不同于抗生素、毒素與抗毒素系統(tǒng)和細(xì)菌類凋亡等目前已報(bào)道的細(xì)菌致死方式[18]，因此篩選的噬菌體裂解基因過表達(dá)系統(tǒng)還可能為致死機(jī)理探索提供一種新模型。