李崇堯，陳瑩瑩，宋鵬，雷璠，武陽，晏彪，馬萍,*

1. 湖北科技學院藥學院，咸寧 437100 2. 湖北科技學院基礎醫(yī)學院，環(huán)境-免疫與神經系統(tǒng)疾病實驗室，咸寧 437100

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)，也被稱為酞酸酯，是一類結構類似的持久性有機污染物，具有特殊氣味，且不溶于水，難揮發(fā)，凝固點低，易溶于有機溶劑，其主要作為增塑劑使用，增加塑料制品的柔韌性和拉伸性[1-2]。廣泛的使用使其大量進入環(huán)境，已成為全球普遍存在的一種環(huán)境污染物。鄰苯二甲酸酯有多種類型，以鄰苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和鄰苯二甲酸丁芐酯(benzylbutyl phthalate, BBP)最為常用，研究表明，DEHP、DBP和BBP有生殖發(fā)育毒性[3]。歐盟成員國已經嚴格限制這3種增塑劑在有關制品中的含量(歐盟2005/84/EC指令)，頒布指令規(guī)定“DEHP、DBP和BBP含量超過0.1%的玩具及兒童護理用品，不得在歐盟市場出售”[2]，并且這3種增塑劑也被歐洲化學品管理局(European Chemical Agency, ECHA)列入高度關注物質(substance of very high concern, SVHC)[4]。與此同時，一批高分子量、低毒性的新型增塑劑開始得到廣泛的應用，鄰苯二甲酸二異癸酯(diisodecyl phthalate, DIDP)就是其中的一種[5-6]。

DIDP可以通過多種途徑進入人體[7]，因其暴露途徑較為簡單，被污染的人群數目眾多，在人體尿液中已檢測出DIDP的一些代謝物[8]，故其潛在的健康威脅已經受到眾多學者的關注。動物實驗研究表明，DIDP雖只具有低毒性，但較高劑量DIDP能使大鼠的存活率和體重下降，肝臟發(fā)生腫脹、重量增加，過氧化物酶體的增生受到促進[9]。Thomas等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DIDP和DEHP一樣，可以使過氧化物酶體發(fā)生大量增殖，造成肝臟腫大。

筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DIDP的同系物鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)可引起小鼠肝腎的氧化損傷，而抗氧化劑褪黑素有拮抗作用[11]。DINP也可造成小鼠肺細胞氧化損傷[12]，維生素E(vitamin E, VitE)在小鼠肺組織氧化損傷中具有拮抗作用[13]。DIDP能否造成機體的肝組織損傷還有待研究，因而，以雄性BALB/c小鼠為受試動物，VitE為拮抗劑，測定肝組織勻漿中氧化應激水平的生物標志物，包括活性氧族(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量以及細胞凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的含量，檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和白蛋白(ALB)水平來評價肝功能，同時觀察肝組織切片的病理變化和熒光染色結果，探究增塑劑DIDP是否通過氧化應激作用導致雄性小鼠肝臟損傷和細胞凋亡，以期為全面評估DIDP的毒性效應及分子機制提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

從湖北省實驗動物研究中心購買6～8周齡雄性BALB/c小鼠70只(合格證號：No. 42000600025582)，飼養(yǎng)在SPF級動物房中。飼養(yǎng)過程中，小鼠養(yǎng)于無菌無病原專用鼠籠內，每日定時定量給予商業(yè)用鼠糧，并及時補充飲用水。動物飼養(yǎng)室內溫度控制在20～25 ℃，室內相對濕度為50%～70%，保持室內安靜，避免強光照對小鼠的影響。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標儀(ELx800，美國Bio-Tek)，多功能熒光酶標儀(Hide Chameleon V，芬蘭Hidex)，低溫冷凍離心機(5424R，德國Eppendorf)，三用電熱溫水箱(HH-42，北京長源)，顯微鏡(DP73，日本Olympus)，動物自動生化分析儀(iMagic-V7，深圳庫貝爾生物)。

主要試劑：鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)，純度≥99.6%，購自Sigma；Hoechst 33258熒光染料，純度>99.9%，購自Sigma；生育酚(ocopherol或vitamin E)，純度≥99%，購自Sigma；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)，純度>99.9%，購自Sigma；蛋白酶K購自Sigma；硫代巴比妥酸(TBA)，購自國藥集團；Folin-酚試劑盒購自北京鼎國昌盛；還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成；8-OHdG ELISA試劑盒購自濟南朋遠；ALT Assay Kit、AST Assay Kit和ALB Assay Kit均購自深圳庫貝爾。

1.3 動物分組與染毒

70只雄性BALB/c小鼠，應用隨機數字表分為7組。包括1個空白對照組，4個DIDP染毒組，1個VitE對照組，1個VitE+DIDP組，每組10只。根據歐洲食品安全局規(guī)定，成年人每天DIDP的最高攝入量為0.15 mg·kg-1[14]。故設置0.15、1.5、15和150 mg·kg-1為染毒梯度，以生理鹽水稀釋成0.015、0.15、1.5和15 mg·mL-14種濃度的使用液，以生理鹽水為陰性對照組；VitE組的劑量為100 mg·kg-1，稀釋液現(xiàn)用現(xiàn)配。對于VitE+DIDP處理組，給予小鼠150 mg·kg-1DIDP 3 h后，再給藥100 mg·kg-1VitE。每組給藥方式均為灌胃，其劑量為每天10 mL·kg-1，連續(xù)染毒14 d。根據Ma等[15]的研究，給予DIDP 3 h后，再用維生素拮抗，目的是為了改善和修復DIDP誘導的氧化損傷。

1.4 血清和肝組織勻漿的制備

染毒結束后，根據小鼠體重按比例腹腔注射1%戊巴比妥鈉，等到小鼠麻醉后，用酒精棉球擦拭，并用手術剪剪開小鼠胸腔處的皮膚，暴露出心臟所在位置的肌肉，然后用1 mL醫(yī)用注射器斜插入其心臟，緩慢抽取0.8～1 mL左右的血液，注射入離心管(1.5 mL)中，在室溫條件下靜置30 min后，在25 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝置于-80 ℃冰箱。

對小鼠進行頸椎脫臼后，取出完整的肝組織，在冷的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.5)中洗凈，用吸水紙吸干水分，然后放至玻璃勻漿器中，加入冷的PBS制成10%的組織勻漿，然后在4 ℃下以10 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝置于-80 ℃冰箱。

1.5 肝組織切片的制備

取完血清后，用頸椎脫臼法處死小鼠，然后立即取出肝組織用PBS沖洗表面的血液，并加入4%的多聚甲醛將其固定，進行H&E染色。

1.6 肝組織熒光染色

稱取Hoechst 33258試劑1 mg，用20 mL蒸餾水溶解后，濾過，4 ℃避光保存。使用時，用10倍的蒸餾水稀釋成染色液，工作濃度為5 mg·L-1。常規(guī)包埋切片后，脫蠟，透明；用PBS或0.9%生理鹽水洗2遍，每次3 min，吸盡液體，手動晃動數次；加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min；用PBS或0.9%生理鹽水洗2遍，每次3 min；將切片置于載玻片上，滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免產生氣泡，然后用Olympus熒光顯微鏡觀察。

1.7 ROS含量的測定

用PBS將肝組織勻漿稀釋100倍，并將熒光染料DCFA-DA按1∶1 000稀釋。然后再加入100 μL的稀釋勻漿液與100 μL的稀釋熒光染料DCFA-DA于酶標板中，輕微搖勻，37 ℃避光5 min，用熒光酶標儀檢測激發(fā)波長485 nm和528 nm處的熒光強度。

1.8 GSH含量和蛋白質含量的測定

嚴格按照GSH試劑盒說明書來測定其含量，按照Folin-酚法來測定蛋白含量。其含量計算方法為：GSH含量(μmol·g prot-1)=[(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準管濃度×樣本稀釋倍數÷待測勻漿蛋白濃度。

1.9 MDA含量測定

取0.5 mL肝組織勻漿，再加入2 mL 0.6% TBA溶液，放入水浴鍋中沸水浴15 min后，用冷水冷卻后，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL于酶標板中測其在450、532和600 nm的吸光值(A450、A532和A600)。MDA含量(cMDA，μmol·mg-1，以prot計)計算公式為cMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450。

1.10 Caspase-3含量的測定

嚴格按照試劑盒操作說明進行測定，標準曲線按照說明書來繪制，并以此為依據來確定樣品中Caspase-3的含量。

1.11 肝功能指標的測定

取小鼠血清200 μL于樣杯中，加入雙蒸水600 μL作3倍稀釋，用于ALT、AST和ALB的檢測來評價肝功能。

1.12 統(tǒng)計分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，多組間均數比較使用單因素方差分析法(ANOVA)，然后使用最小顯著性差異法(LSD)檢測兩組間均數的差異性，P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果(Results)

2.1 小鼠肝組織形態(tài)的光鏡觀察結果

如圖1所示，對照組肝組織結構正常。0.15 mg·kg-1DIDP組肝細胞輕度水腫，肝索清晰，肝索肝竇比例尚可。1.5 mg·kg-1DIDP組肝細胞有中度水腫，肝索可見增寬，索竇受壓。15 mg·kg-1DIDP組肝細胞有重度水腫，肝索很亂，肝索肝竇比例失常，肝細胞壞死。150 mg·kg-1DIDP組中央靜脈擴張、淤血；肝細胞水腫，胞漿疏松化，體積增大；肝索結構尚清晰，肝竇變窄。與空白對照組相比，VitE對照組肝組織結構和細胞形態(tài)正常，而150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組肝索增寬，索竇受壓變窄，肝細胞水腫輕于150 mg·kg-1DIDP組。結果表明，小鼠肝細胞的病理損傷隨著DIDP劑量逐漸增高而不斷加重。給予VitE后，肝細胞損傷得到減輕。

2.2 小鼠血清ALT與AST含量的變化

ALT與AST均是肝細胞損傷的敏感性指標。如圖2所示，隨著DIDP染毒劑量的升高，血清中ALT與AST含量也逐漸上升。與生理鹽水組相比，高劑量組(150 mg·kg-1)血清ALT含量顯著升高(P<0.05)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清ALT含量顯著減少。與生理鹽水組比較，中高劑量組(15 mg·kg-1)與高劑量組(150 mg·kg-1)血清AST含量顯著升高(P<0.05)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清AST含量顯著減少(P<0.05)。

2.3 小鼠血清ALB含量的變化

ALB反映肝臟慢性損害情況。如圖3所示，隨著DIDP染毒劑量的升高，血清ALB含量逐漸下降。與生理鹽水組比較，高劑量組(150 mg·kg-1DIDP)血清ALB含量顯著減少(P<0.01)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的血清ALB含量顯著升高(P<0.05)。

圖1 不同處理組小鼠肝切片圖(10×40，H&E染色)注：A. 生理鹽水組；B. 0.15 mg·kg-1 DIDP組；C. 1.5 mg·kg-1 DIDP組；D. 15 mg·kg-1 DIDP組；E. 150 mg·kg-1 DIDP組；F. 100 mg·kg-1 VitE組；G. 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組；DIDP為鄰苯二甲酸二異壬酯，VitE為維生素E。Fig. 1 Liver slices of different groups (10×40, H&E stains)Note: A. Saline group; B. 0.15 mg·kg-1 DIDP group; C. 1.5 mg·kg-1 DIDP group; D. 15 mg·kg-1 DIDP group; E. 150 mg·kg-1 DIDP group; F. 100 mg·kg-1 VitE group; G. 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group; DIDP is didecyl phthalate and VitE is vitamin E.

2.4 小鼠肝組織ROS含量的變化

各組小鼠肝組織的ROS測定結果如圖4所示。與生理鹽水組比較，0.15、1.5和15 mg·kg-1DIDP組均無統(tǒng)計學意義，150 mg·kg-1DIDP組有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高劑量的DIDP能造成ROS含量的上升。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的ROS含量顯著下降。

2.5 小鼠肝組織GSH含量的變化

各組小鼠肝組織的GSH含量測定結果如圖5所示。與生理鹽水組比較，中低劑量組(0.15、1.5和15 mg·kg-1)無統(tǒng)計學差異，高劑量組(150 mg·kg-1)有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。高劑量的DIDP可使小鼠肝GSH含量下降。與單獨DIDP組(150 mg·kg-1)比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組中的GSH含量顯著上升。

圖2 不同處理組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)與天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量(n=6)注：* P<0.05，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 2 Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) content in mouse serum of different groups (n=6)Note: * P<0.05, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖4 不同處理組小鼠肝活性氧(ROS)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組相比較；## P<0.01，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 4 Reactive oxygen species (ROS) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; ## P<0.01, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖5 不同處理組小鼠肝還原型谷胱甘肽(GSH)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 5 Glutathione (GSH) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

2.6 小鼠肝組織MDA含量的變化

不同處理組肝組織的MDA含量變化如圖6所示。與生理鹽水組比較，中低劑量組(0.15、1.5和15 mg·kg-1)無統(tǒng)計學差異，高劑量組(150 mg·kg-1)的MDA含量顯著升高(P<0.01)。與150 mg·kg-1的DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的MDA含量顯著下降。

2.7 小鼠肝組織Caspase-3含量的變化

各組小鼠肝組織的Caspase-3含量測定結果如圖7所示。隨著DIDP染毒劑量的升高，Caspase-3含量逐漸上升。與生理鹽水組比較，高劑量組(150 mg·kg-1)Caspase-3含量顯著升高(P<0.01)。與150 mg·kg-1DIDP組比較，150 mg·kg-1DIDP+100 mg·kg-1VitE組的Caspase-3含量顯著減少。

2.8 小鼠肝組織的熒光染色觀察結果

通過Hoechst 33258熒光染料對小鼠肝組織進行熒光染色，染色后的細胞核呈藍色，細胞質及其他組織呈綠色。如圖8所示，生理鹽水組中細胞核大多數呈圓形或橢圓形、淡藍色，視野內細胞核分布密集。但隨著DIDP染毒劑量的上升，細胞核大多數不

規(guī)則，開始變形并且縮小，呈亮藍色，細胞核內凋亡小體明顯增多。在最高劑量150 mg·kg-1DIDP組中，細胞核內凋亡小體數目最多。

圖6 不同處理組小鼠肝丙二醛(MDA)含量(n=6)注：** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 6 Malondialdehyde (MDA) content in mouse liver of different groups (n=6)Note: ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

圖7 不同處理組小鼠肝Caspase-3含量(n=6)注：* P<0.05、** P<0.01，與生理鹽水組比較；# P<0.05，與150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE組比較。Fig. 7 Caspase-3 content in mouse liver of different groups (n=6)Note: * P<0.05, ** P<0.01, compared with the saline group; # P<0.05, compared with the 150 mg·kg-1 DIDP+100 mg·kg-1 VitE group.

3 討論(Discussion)

生物體內的新陳代謝都會伴隨著有氧氧化，而肝臟作為人體內的重要器官，其代謝功能十分活躍，因而，需要大量的氧和營養(yǎng)物質來維持，并且會在有氧代謝過程中產生大量的ROS，發(fā)生氧化應激。氧化應激能夠造成機體內物質的損傷，引起肝組織損傷，進而造成肝組織細胞凋亡和肝組織炎癥的發(fā)生。Ma等[11]的研究表明，氧化應激的積累可能是鄰苯二甲酸酯致肝臟損傷和毒理作用的重要分子機理。ROS是分子氧在還原過程中的一系列中間產物[16]。ROS在機體正常代謝狀態(tài)下含量很低，受到刺激后大量增多，氧化應激的產生是因為ROS的累積，其可使組織出現(xiàn)不同程度的損傷[17]。GSH是ROS的主要清除劑，GSH的消耗可以反映機體的氧化損傷程度[18]。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組肝組織中的ROS水平顯著增加，并且GSH含量顯著降低，表明高劑量DIDP產生過量的活性氧物質；同時，機體的氧化平衡因為GSH的大量減少而遭到破壞。

脂質過氧化可以由過量的ROS直接或間接地攻擊脂質分子所造成，導致細胞膜流動性和脆性的改變。膜組分之間的交聯(lián)增加細胞膜和膜細胞器的通透性，導致細胞穩(wěn)態(tài)功能障礙，如離子轉運和能量代謝[18]。脂質過氧化的主要代謝產物是MDA，其水平代表脂質過氧化的強弱與快慢。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組的MDA含量顯著增加，表明高劑量DIDP誘導小鼠肝細胞中的脂質過氧化，損傷了細胞膜結構。

病理學觀察結果顯示，小鼠的肝組織會隨著DIDP染毒劑量的不斷升高而出現(xiàn)不同程度的病理損傷。15 mg·kg-1DIDP組肝細胞有嚴重水腫，肝索排列無序，肝索肝竇比例失常，肝細胞壞死。150 mg·kg-1DIDP組中央靜脈擴張、淤血；肝細胞水腫，胞漿疏松化，體積增大；肝索結構尚清晰，肝竇變窄。這表明，較高劑量DIDP可對肝細胞內部造成實質性的損傷，從而影響到肝功能。

正常情況下，AST主要存在于組織細胞中，其中心肌細胞含量最高，其次為肝臟，但其在血清中含量較低[19]。當肝細胞變性時，細胞膜通透性明顯增加，從細胞內分泌出來的主要是ALT，而當肝細胞壞死嚴重時，線粒體內的AST便釋放出來。AST含量高可以反映肝細胞損傷嚴重，更能反映肝細胞受損傷的嚴重程度。極少數的肝細胞損傷，就可引起ALT含量的成倍增高。因此，ALT被推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標[20]。本研究中，150 mg·kg-1DIDP組ALT含量顯著上升，15 mg·kg-1和150 mg·kg-1DIDP組AST含量顯著上升，表明中高劑量的DIDP能使小鼠肝細胞嚴重受損。

ALB是血清中蛋白質的一種，并且其在血清中含量最高，約占總體含量的57%～68%[21]。血清中ALB主要是由肝臟合成[22]，ALB也是反映肝功能的重要指標，多種情況均可引起血清中ALB變化[23]。本研究中，150 mg·kg-1DIDP組ALB含量顯著下降，說明高劑量的DIDP能導致小鼠肝功能異常。

圖8 DIDP不同處理組小鼠肝組織熒光染色結果(10×40)Fig. 8 Fluorescence staining of mouse liver tissue in different treatment groups of DIDP (10×40)

由上述結果可知，隨著DIDP染毒劑量的增加，肝組織病理損傷程度逐漸嚴重，肝細胞壞死情況也愈加嚴重，進而導致血清中肝功能標志物AST在DIDP中、高劑量組水平異常，同時，ALB水平在DIDP中、高劑量組水平也有異常。本研究中肝功能指標印證了肝臟組織切片觀察結果。

細胞凋亡下游的關鍵酶是Caspase蛋白酶，而Caspase-3是其家族中最重要的成員之一。大多數細胞凋亡均需要通過Caspase-3來實現(xiàn)介導[24]?？梢哉f，Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行因子。研究表明，氧化損傷可以誘導線粒體開放通透轉換孔[25]，而其開放可激活Caspase-3的表達[26]。研究廣泛證實，ROS和氧化應激可通過觸發(fā)細胞內Caspase級聯(lián)效應介導細胞凋亡的發(fā)生[27-28]。在本研究中，150 mg·kg-1DIDP組Caspase-3含量顯著上升，說明高劑量的DIDP能使小鼠肝細胞凋亡因子Caspase-3的形成增多。通過Hoechst 33258熒光染色分析結果表明，當DIDP的染毒濃度達到15 mg·kg-1以上時，細胞核開始變形，核由于濃集由淡藍色逐漸變?yōu)榱了{色，細胞核內凋亡小體明顯增多，說明較高劑量的DIDP可造成小鼠肝組織細胞凋亡。

VitE是一種具有代表性的脂溶性天然抗氧化劑。它是維持身體正常新陳代謝的必需元素，因其多種生理功能而被廣泛使用[29]。而VitE能在體內發(fā)揮強大的抗氧化作用，清除自由基，具有保護細胞膜的功能[30-31]。對150 mg·kg-1DIDP組添加保護劑VitE后，其肝組織的ROS和Caspase-3含量均顯著下降，GSH含量顯著上升，肝功能損傷與肝組織的病理損傷減輕，說明VitE可以降低由肝組織氧化應激所引起的肝臟損傷和細胞凋亡，對其有一定的拮抗作用。

綜上所述，較高劑量的DIDP(≥15 mg·kg-1)誘導下，小鼠肝組織產生過量的ROS，破壞自身的氧化與抗氧化平衡，造成機體氧化應激。而氧化應激能夠造成機體內物質的損傷，引起各種病理學損傷，進而造成肝功能損傷與細胞凋亡?？寡趸瘎￢itE可通過拮抗氧化應激，對機體形成保護作用。本研究結果證明了DIDP通過氧化應激作用導致雄性小鼠肝臟損傷和細胞凋亡，為進一步研究DIDP的毒性及分子機制提供了科學依據。