董聰聰，張紅波，楊燕君，付君珂，劉黎，賀新宇，施軍瓊，吳忠興

西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715

四環(huán)素類抗生素(TCs)是由放線菌金色鏈叢菌產(chǎn)生的或半合成的一類廣譜抗生素，主要包括四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)等[1-2]，它可以與細菌核糖體30s亞基結(jié)合，阻止酰胺-tRNA進入A位點，抑制蛋白質(zhì)合成，影響細菌生長繁殖[3-4]。從20世紀50年代起，四環(huán)素類抗生素作為人類常用抗生素用于醫(yī)療行業(yè)，因其具有廣譜抗菌性、價格低廉和使用方便等特點，常作為獸藥、飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)[5]。四環(huán)素類抗生素作為全球第二大生產(chǎn)和使用的抗生素，每年有數(shù)千噸在全球范圍內(nèi)生產(chǎn)[6-7]。研究已表明，抗生素在人畜體內(nèi)不能被完全吸收，有30%～90%以尿液、糞便的形式排出體外；同時，四環(huán)素具有良好的水溶性，容易通過地表水進入到湖泊、河流等水環(huán)境中[8-9]。Hamscher等[10]檢測到在液體糞肥中四環(huán)素的含量可達4.0 mg·kg-1；Miao等[11]在對加拿大污水處理情況的長期監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，處理后的污水中仍殘留0.15～0.97 μg·L-1的四環(huán)素；在中國北方地區(qū)13個陸源入海排污口/河流的水樣檢測中，四環(huán)素最高濃度為1.114 μg·L-1 [12]；在廣州魚塘水中四環(huán)素含量可達5.16 μg·L-1，檢出率為28.6%[13]；然而，姜蕾等[14]在對長江三角洲地區(qū)典型廢水的檢測中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)豬場廢水中四環(huán)素類抗生素殘留濃度為31.02～100.75 μg·L-1。已有研究表明，四環(huán)素能夠降低水生苦草的葉綠素含量，削弱光合作用，抑制苦草的生長[15]。同樣，四環(huán)素通過抑制水生動物體內(nèi)多種酶的活性，對魚類等造成DNA損傷[16]。因此，四環(huán)素類抗生素對水生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的潛在威脅值得關(guān)注。而中國目前對于這一問題的研究尚顯不足[17]。

藻類作為初級生產(chǎn)者在水體生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要的作用[18]。外源污染物對藻類的毒性作用將直接影響水生食物鏈的能量傳遞，進而對高營養(yǎng)級生物和整個水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[5]。四環(huán)素類抗生素對藻類的毒性試驗表明，四環(huán)素類抗生素能夠抑制斜生柵藻和蛋白核小球藻的生長，但由于四環(huán)素種類及濃度的差異性，導(dǎo)致其對藻細胞的膜通透性的影響也不盡相同[5]。四環(huán)素還能夠抑制銅綠微囊藻的光合作用，破壞抗氧化酶系統(tǒng)，抑制藻類生物量增長[19-20]。光合作用可為植物的生命活動提供物質(zhì)與能量，是植物生長發(fā)育的重要保障[21]。然而，以往的研究多集中于四環(huán)素類抗生素對藻類的敏感性、生長情況和抗氧化酶系統(tǒng)的影響等方面，而對光合響應(yīng)及作用機制等方面的研究較少。因此，以水體常見的水華藍藻——微囊藻(Microcystisaeruginosa)為研究材料，探究不同濃度下四環(huán)素對藍藻的生長、光合系統(tǒng)Ⅱ的影響，旨在探究四環(huán)素對微囊藻的毒性效應(yīng)，為揭示四環(huán)素對浮游植物的急性毒性作用和致毒機理提供一定的理論依據(jù)；同時，對于全面認識四環(huán)素類抗生素對淡水藍藻的毒性作用、評價該類物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料及培養(yǎng)條件

微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。純化后的藻種擴大培養(yǎng)至對數(shù)期，接種于含四環(huán)素(購自aladdin?，分析純)的MA培養(yǎng)基[22]中，初始接種密度約為1.744×109cells·L-1。結(jié)合已有對綠藻和微囊藻的研究[3,5,18]以及預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置各處理組中的四環(huán)素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg·L-1，以0 mg·L-1作為對照組。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，培養(yǎng)條件為光強50 μmol photons·m-2·s-1、光照周期12 h L:12 h D、培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，每天按時搖動3次，并調(diào)換各個培養(yǎng)瓶位置，以保證藻細胞和培養(yǎng)液充分接觸和受光均勻。

1.2 葉綠素a含量和細胞密度的測定

每天取藻液5 mL用于葉綠素a的測定。葉綠素a的提取參照Nush[23]的方法，用90%的丙酮進行抽提，采用紫外分光光度計(UV-1206，Shimadzu)測定微囊藻在663、645、630和750 nm處的吸光值，Chla(mg·L-1) = [11.64×(D663-D750)-2.16×(D645-D750)+0.10×(D630-D750)]×Vt/(V×δ×1000)，Vt為丙酮定容的體積(L)，V為提取所用的藻液體積(mL)，δ為比色皿光程[24]。已有研究表明，微囊藻不同藻細胞密度與680 nm波長的吸光值呈良好的線性關(guān)系[25]，由顯微鏡下計數(shù)所得的微囊藻細胞數(shù)和微囊藻在680 nm處測得的吸光值計算出微囊藻細胞密度(y,107cells·L-1)與680 nm處吸光值(x)的線性方程為y= 1186.1x-42.236,回歸系數(shù)R2= 0.9929。每天測定各處理組的OD680值，并根據(jù)線性公式計算各處理組的藻細胞密度。比生長速率(μ)根據(jù)公式μ= (lnN0-lnN1)/(t1-t0)計算，N0、N1分別表示t1、t0時刻的細胞數(shù)。

四環(huán)素對微囊藻的半致死濃度(4 d-LC50和7 d-LC50)則采用概率單位法計算[26]，由SPSS22.0(IBM, USA)中的“probit”模型計算得出。由第4天和第7天的細胞數(shù)分別計算出0.1、0.2、0.5、1、2和5 mg·L-1濃度下的生長抑制率。以“抑制率”作為“響應(yīng)頻率”，“觀測值匯總”為“100%”，“對數(shù)轉(zhuǎn)換后的四環(huán)素濃度”作為“協(xié)變量”，然后，通過SPSS22.0中probit模型進行計算，概率為0.5的對應(yīng)濃度值即為LC50值。

1.3 微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)快速光響應(yīng)曲線(RLCs)和快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP)的測定

RLCs的測定采用PHYTO-PAM浮游植物分析儀(PHYTO-PAM Phytoplankton Analyzer, Walz, Effeltrich, Germany)。測定前，將各處理組藻液暗適應(yīng)20 min，測定時共設(shè)置0、32、64、128、256、384、512、704、960、1216、1 600和1 984 μmol·m-2·s-1共12個水平的光合有效輻射強度，每個光照水平間隔20 s[27]。RLCs曲線的擬合參照Platt等[28]的公式：

rETR = ETRmax·(1-e-aPAR/ETRmax)·e-βPAR/ETRmax

式中：rETR為相對電子傳遞速率；ETRmax為最大相對電子傳遞速率；PAR為光合有效輻射強度；α為RLCs曲線的斜率；β為抑制參數(shù)。OJIP曲線的測定是通過植物效率分析儀(Handy-Plant Efficiency Analyzer, Hansatech, UK)進行測定。所有樣品進行測定前暗適應(yīng)20 min[29]，測定結(jié)果以瞬時曲線形式繪制熒光信號，儀器中的JIP-測試(JIP-test)用于對葉綠素a熒光瞬變現(xiàn)象的多相增長進行分析[30]，參數(shù)以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PIABS)、用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEo)、最大光化學(xué)效率(φPo)、用于熱耗散的量子比率(φDo)、反應(yīng)中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞鏈中超過QA的其他電子傳遞的量子產(chǎn)額(ψo)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)、單位反應(yīng)中心耗散掉的能量(DIo/RC)、單位受光面積的反應(yīng)活性中心數(shù)量(RC/CSo)、單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)和從開始照光至到達FM的時間段內(nèi)QA被還原的次數(shù)(N)從JIP測定中計算獲得。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗中每組處理設(shè)置3個平行，實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0(IBM, USA)進行One-way ANOVA及LSD多重比較，擬合曲線用軟件Origin 9.0(https://www.originlab.com)進行擬合?！?”表示P<0.05、“**”表示P<0.01，具顯著差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 葉綠素a含量和比生長速率(μ)

不同濃度四環(huán)素處理下，微囊藻葉綠素a含量變化如圖1(a)所示，結(jié)果表明，1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環(huán)素處理，微囊藻葉綠素a含量顯著低于對照組(P<0.01)，而0.1、0.2和0.5 mg·L-1四環(huán)素處理下，微囊藻葉綠素a含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。隨著四環(huán)素濃度的升高，微囊藻的比生長速率顯著下降(圖1(b))，2.0和5.0 mg·L-1四環(huán)素處理7 d后，微囊藻的生長被顯著抑制(P<0.01)，其比生長速率數(shù)值分別為-(0.186±0.057) d-1和-(0.516±0.080) d-1，而0.1、0.2和0.5 mg·L-1處理組與對照相比無顯著差異(P>0.05)。四環(huán)素處理4 d后，微囊藻半致死濃度4 d-LC50為(0.698±0.037) mg·L-1。第7天時，7 d-LC50為(0.571±0.036) mg·L-1。

2.2 快速光響應(yīng)曲線(RLCs)

PSⅡ快速光響應(yīng)曲線結(jié)果如圖2和表1所示，結(jié)果表明，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環(huán)素處理7 d后，微囊藻rETRmax相比于對照組分別降低了44.04%、46.05%和57.52%(P<0.01)；光飽和點(IK)與對照組相比分別下降了17.04%、32.18%和33.55%(P<0.01)。光響應(yīng)曲線的斜率(α)在四環(huán)素濃度為5.0 mg·L-1時表現(xiàn)出明顯差異(P<0.01，表1)。然而，在0.1、0.2和0.5 mg·L-1四環(huán)素處理下，rETRmax、IK和α與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同濃度四環(huán)素處理下微囊藻的葉綠素a含量和比生長速率(μ)Fig. 1 Effect of different concentrations of tetracycline on chlorophyll a content and specific growth rate (μ) in Microcystis aeruginosa

圖2 不同濃度四環(huán)素處理7 d后微囊藻的快速光響應(yīng)曲線(RLCs)Fig. 2 Rapid light curves (RLCs) of Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracyclineNote: rETR stands for relative electron transfer rate; PAR stands for photosynthetic active radiation.

2.3 PSⅡ快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(OJIP)及相關(guān)參數(shù)

不同四環(huán)素濃度對微囊藻OJIP曲線如圖3所示，結(jié)果表明，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環(huán)素濃度處理下，微囊藻OJIP曲線的J點顯著升高，而低濃度處理組的OJIP曲線與對照相比無顯著變化。

進一步對JIP測定的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進行分析，結(jié)果表明，受四環(huán)素的影響，微囊藻RC/CSo顯著下降，且隨四環(huán)素濃度增加逐漸下降(P<0.01，圖4(c))。在低濃度處理組(<0.5 mg·L-1)，PIABS、φEo和φPo隨著處理濃度的增加而升高(圖4(a)和圖4(c))，然而，高濃度處理組(>1.0 mg·L-1)中，PIABS、φEo和φPo則隨著處理濃度的增加顯著降低(P<0.05，圖4(b)和圖4(c))。在1.0、2.0和5.0 mg·L-1處理組中，ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、N和φDo隨四環(huán)素濃度的增加而顯著增大(P<0.01，圖4(b)和圖4(c))，然而，ETo/RC、ψo卻隨著四環(huán)素的增加顯著降低(P<0.01，圖4(a)和圖4(b))。

表1 不同濃度四環(huán)素處理7 d后微囊藻的快速光響應(yīng)曲線參數(shù)Table 1 Parameters of RLCs for responses in Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracycline

注： rETRmax表示最大相對電子傳遞速率，IK表示飽和光強，α表示光合效率。
Note: rETRmaxstands for the maximum relative electron transfer rate;IKstands for the saturation light intensity;αstands for photosynthetic efficiency.

圖3 不同濃度四環(huán)素處理7 d后微囊藻的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)(OJIP)曲線Fig. 3 Fast fluoresence transient curves of Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracycline

3 討論(Discussion)

四環(huán)素類藥物具有較好的水溶性，容易隨雨水沖刷和養(yǎng)殖廢水中進入到水環(huán)境中。郭曉等[31]在對梅江流域四環(huán)素類抗生素空間分布及其遷移轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素從該流域養(yǎng)豬場逐漸遷移到小溪流，并最終匯入干流，使得四環(huán)素類抗生素對河流生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了一定威脅。研究表明，四環(huán)素類抗生素對微藻的毒性主要表現(xiàn)在通過抑制蛋白質(zhì)合成和葉綠體的生成進而抑制微藻的生長[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著四環(huán)素濃度的增大，微囊藻的葉綠素含量和生長受到一定程度的影響。與對照組相比，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1高濃度處理組，微囊藻的生長和葉綠素合成均受到抑制(圖1)。這與四環(huán)素類抗生素土霉素對鞭金藻光合色素含量影響的研究結(jié)果一致[32]，表明高濃度四環(huán)素能抑制微囊藻的生長。然而，周旭東[33]對銅綠微囊藻的研究表明，低濃度(0.1～2 mg·L-1)四環(huán)素類抗生素對銅綠微囊藻的生長影響較小，當(dāng)四環(huán)素濃度為0.1 mg·L-1時表現(xiàn)出促進作用。本研究中，0.1 mg·L-1的四環(huán)素雖然也促進了微囊藻的生長，但促進作用并不顯著。低濃度(<1 mg·L-1)的四環(huán)素處理組中，微囊藻的生長和葉綠素含量與對照相比無顯著差異(圖1)，表明微囊藻能夠耐受低濃度的四環(huán)素。Kühne等[34]在模擬四環(huán)素在水中降解實驗中發(fā)現(xiàn)，在室溫、自然光照且通風(fēng)的情況下，四環(huán)素濃度在8 d后下降了約17.9%。因此，推測四環(huán)素的降解可能部分稀釋了其對微囊藻的毒性，導(dǎo)致微囊藻的生長未受到顯著影響。

在徐冬梅等[5]的研究中，四環(huán)素對蛋白核小球藻和斜生柵藻培養(yǎng)4 d時的LC50分別為17.780和12.870 mg·L-1，而本研究中微囊藻的4 d-LC50值為0.698 mg·L-1，這表明實驗所用的微囊藻對四環(huán)素的敏感性要明顯高蛋白核小球藻和斜生柵藻。不同藻種對抗生素的敏感性存在一定的差異[35]，且微囊藻細胞要小于柵藻、小球藻的細胞，細胞表面積大于柵藻、小球藻等藻類[36]，因此，其接觸到四環(huán)素的面積也較多，可能是導(dǎo)致其敏感性較高的一個原因。

植物體在一定條件脅迫下，其葉綠體的膜結(jié)構(gòu)受到破壞，葉綠素含量將隨葉綠體膜結(jié)構(gòu)的解體而降低，進而降低植物的光合能力[37]。rETRmax表示光合效率的大小，被用來描述PSⅡ的最大光化學(xué)效率和開放氧化反應(yīng)中心的所占比例[38]。本次研究得到，在四環(huán)素濃度>1.0 mg·L-1時，微囊藻的rETRmax隨濃度增加而減小(表1)，表明微囊藻的光合作用受到了抑制，開放反應(yīng)中心的比例降低，這與OJIP參數(shù)中RC/CSo的結(jié)果相一致。IK的大小表示植物耐受強光的能力[39]，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度高于0.5 mg·L-1時,微囊藻的IK隨濃度增加而減少(表1)，表明在高濃度四環(huán)素的脅迫下，微囊藻的耐受強光能力減弱。α是快速光曲線的初始斜率，表示藻的捕光能力[40]，本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為5.0 mg·L-1時，微囊藻的α值顯著低于對照(表1)，表明微囊藻在高濃度四環(huán)素的脅迫下捕光能力減弱。

藻類光合作用的原初反應(yīng)與葉綠素?zé)晒饩o密相關(guān)，葉綠素?zé)晒饪梢苑从彻夂献饔弥蟹磻?yīng)中心、供體側(cè)和受體側(cè)所處的氧化還原狀態(tài)[41-42]。當(dāng)外界環(huán)境條件發(fā)生改變時，葉綠素?zé)晒獍l(fā)生相應(yīng)變化，這可以在一定程度上反映環(huán)境因子對植物的影響[43]。在對四環(huán)素的研究中發(fā)現(xiàn)，對煙草生長發(fā)育及光合作用的生態(tài)毒性效應(yīng)呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并且四環(huán)素可以促進煙草生育后期光合參數(shù)的提高[44]。性能指數(shù)PIABS可以衡量PSⅡ的整體性能，能夠靈敏地反映光合系統(tǒng)的變化[43]。本研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素處理后，微囊藻RC/CSo顯著減少(圖4(c))，表明四環(huán)素使微囊藻部分反應(yīng)中心(RCs)失活。有研究表明，RCs數(shù)量的減少會推動對光能吸收的調(diào)節(jié)，以保持光合系統(tǒng)中能量的平衡，并且過多的能量會通過熱能或熒光的形式耗散掉[45-46]，且ABS/RC的升高也與RCs的失活有關(guān)[47-48]。在高濃度四環(huán)素處理下(>1.0 mg·L-1)，微囊藻的ABS/RC、DIo/RC和ψDo顯著升高(P<0.05，圖4(a)和圖4(b))，表明微囊藻反應(yīng)中心失活程度升高，使得單位反應(yīng)中心吸收的光能增大，同時耗散掉的能量也增多。然而，PIABS、φPo、φEo和ETo/RC顯著低于對照組(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))，表明微囊藻用于電子傳遞鏈的量子產(chǎn)額和能量減少，光合作用整體受到抑制[49]，這與光響應(yīng)曲線中高濃度處理組rETRmax和IK顯著低于對照組的結(jié)果相一致，表明較高濃度四環(huán)素對微囊藻造成脅迫，超出了其自身調(diào)節(jié)限度，顯著抑制了微囊藻的光合作用。而在低濃度四環(huán)素處理下，微囊藻熒光參數(shù)中PIABS和φPo顯著升高，ψDo和DIo/RC隨四環(huán)素濃度增加逐漸降低(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))。以上參數(shù)變化表明，在低濃度四環(huán)素處理下，微囊藻通過降低反應(yīng)中的熱耗散，增加了用于光合作用的能量配額，提高光合效率以應(yīng)對四環(huán)素脅迫[50]。

圖4 不同濃度四環(huán)素處理7 d后微囊藻的快速光響應(yīng)曲線參數(shù)注：φPo表示最大光化學(xué)效率，ψo表示反應(yīng)中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞鏈中超過QA的其他電子傳遞的量子產(chǎn)額，φEo表示用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，φDo表示用于熱耗散的量子比率，ABS/RC表示單位反應(yīng)中心吸收的光能，DIo/RC表示單位反應(yīng)中心耗散掉的能量，TRo/RC表示單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量，ETo/RC表示單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量，N表示從開始照光至到達FM的時間段內(nèi)QA被還原的次數(shù)，RC/CSo表示單位受光面積的反應(yīng)活性中心數(shù)量，PIABS表示以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)。 Fig. 4 Parameters of fast fluoresence transient curves for responses in Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracyclineNote: φPo stands for the maximum photochemical efficiency; ψo stands for the quantum yield of the exciton captured by the reaction center to promote other electron transfer in the electron transfer chain that exceeds QA; φEo stands for the quantum yield for electron transfer; φDo stands for the quantum ratio for heat dissipation; ABS/RC stands for the light energy absorbed by the single reaction center; DIo/RC stands for the energy dissipated by the unit reaction center; TRo/RC stands for the energy captured by unit reaction center for reducing QA; ETo/RC stands for the energy captured by unit reaction center for electron transfer; N indicates the number of times that QA is reduced during the period from the beginning of illumination to FM; RC/CSo stands for the number of reaction active centers per unit light receiving area; PIABS stands for the performance index based on absorbed light energy.