李亞巍， 王小潔, 吳 群， 李士謠， 李雙榮， 朱立武， 劉 普

(1. 安徽農業(yè)大學 園藝學院， 合肥 230036; 2. 安徽大學 生命科學學院， 合肥 230601; 3. 浙江省衢州市經濟特產站， 衢州 324002)

獼猴桃(ActinidiaLindl)是20世紀以來馴化的一種新興藤本果樹。我國為獼猴桃屬植物的分布中心和主產國，獼猴桃在我國自然界中分布廣，其經濟價值高，果實營養(yǎng)豐富，特別是膳食纖維和維生素C含量較高[1]。

獼猴桃潰瘍病(Bacterial canker of kiwifruit)是由丁香假單胞獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae, Psa)引起的檢疫性細菌病害，主要危害獼猴桃的葉片、枝蔓和主干等。獼猴桃潰瘍病菌屬于典型低溫型病害，病菌最適的發(fā)病溫度為20℃以下，病菌GFPuv標記的研究結果顯示4℃下病菌可以快速在組織中擴散蔓延，25℃侵染速度明顯減緩[2]，因此病菌在周年中呈現(xiàn)出兩次發(fā)病高峰[3]。該病菌同時還具有發(fā)生范圍廣、傳播迅速、致病性強和防治難度大等特點，極易在短期內造成大面積樹體死亡。該病自1984年在日本[2]首次發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已在四大洲數(shù)十個國家中出現(xiàn)并造成危害[5-11]。在我國，獼猴桃潰瘍病最早發(fā)生于湖南東山峰農場[8]和安徽岳西縣主簿鎮(zhèn)[12]等并造成毀園，隨著‘紅陽’等潰瘍病敏感品種的推廣和苗木調運，目前在我國16個省份的獼猴桃種植區(qū)均已發(fā)生有潰瘍病危害[13-15]。中國、新西蘭、美國和歐洲植物保護組織(EPPO)已分別將獼猴桃潰瘍病菌作為植物檢疫對象和A2類檢疫性有害生物，以控制該病害的迅速蔓延。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，世界獼猴桃潰瘍病菌存在5種不同的致病基因型，即Psa-J[16-17](含有編碼菜豆毒素基因簇)，Psa-K[18](含有編碼冠菌素基因簇)，Psa-V[19](缺乏編碼菜豆毒素和冠菌素基因簇)，Psa-LV[20-21](缺少部分effector基因簇，現(xiàn)已定名為P.syringaepv.actinidifoliorumpv. nov)和biovar 5[22]，不同基因型菌株存在著明顯的致病差異。前期國內外學者針對病菌的流行病學進行了大量研究，結果表明：潰瘍病菌主要借助風雨，通過傷口以及自然的皮孔和氣孔等途徑來實現(xiàn)侵染，病害還與氣象因素中溫度、濕度和光照關系密切，低溫凍害可以促進病害發(fā)生和流行[20]。最近有研究結果顯示花粉也是潰瘍病傳播的主要途徑，同時我們發(fā)現(xiàn)葉蟬可以作為中間媒介、狗尾巴草可以作為病菌的中間寄主來實現(xiàn)病菌的傳播和侵染[23-25]。然而，針對獼猴桃潰瘍病菌在自然環(huán)境下田間植株不同部位分布及其侵染后傳播規(guī)律，以及土壤等潛在初侵染源的研究較少。鑒于此，本研究主要針對田間獼猴桃潰瘍病菌可能在植株不同區(qū)域分布，研究可能的初侵染源和潛伏部位，初侵染途徑和傳播規(guī)律，為生產實際中獼猴桃潰瘍病的防治提供一些借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

2012—2017年，對兩處(安徽省安慶市岳西縣主簿鎮(zhèn)和安徽省六安市金寨縣)典型獼猴桃潰瘍病發(fā)生地區(qū)進行監(jiān)測和取樣，每年3、4、10、11月對每個園區(qū)按照5點取樣法取樣，每個點選取大小、長勢基本一致的3棵植株。對每棵植株可能的潰瘍病菌的田間分布地點進行取樣分析，取樣點分別為：1)地上(主蔓、主枝、側枝、新稍、葉片)；2)地下(根際土壤、表土、根系)等部位分別進行3次重復取樣，4℃保存。掃描電鏡所需的葉片表面用75%酒精消毒后用無菌手術刀取0.5 cm × 0.5 cm的區(qū)域，將樣品抽真空后放進盛有5%戊二醛固定液的無菌的離心管中，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 地上部位菌株的分離

主蔓、主枝、側枝、新稍部位和葉片的處理方法：切取0.5 cm × 0.5 cm的正方形疑似病害組織于次氯酸鈉中消毒30 s后無菌水清洗切碎。采用平板劃線法接種于選擇性培養(yǎng)基(SS)上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[1, 14]，每個部位3次重復。本試驗采用標準獼猴桃潰瘍病致病基因型Psa-V菌株7285、以及本實驗室早期在岳西縣主簿鎮(zhèn)主栽品種‘金豐’中分離出的JF8作為對照組試驗；從4℃冰箱中分別取出已保存的菌株，平板劃線法接種于SS培養(yǎng)基上，處于相同的試驗條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2 地下部位菌株的分離

根系潛在病原菌分離方法同1.2.1地上部位Psa菌株的分離操作。

根際土壤、表土的處理方法：0.5 g土壤樣品充分溶解于500 μL無菌水中，平板劃線法接種于SS培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[1]。每個部位3次重復。另采用Biomiga公司Soil gDNA Kit 試劑盒所提供的方法，直接提取土壤中微生物DNA。

1.2.3 菌株的純化

于1.2.1與1.2.2中培養(yǎng)2 d的菌板中挑選與對照組標準菌株7285和JF8形態(tài)學類似的菌株單菌落進行標記。采用平板劃線法將疑似菌株接種于金氏B培養(yǎng)基(KB)上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后于KB培養(yǎng)基上富集疑似菌株。再次培養(yǎng)2 d后挑取足量的菌體，于100 μL無菌水中渦旋均勻后裂解10 min取出，離心取上清于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病原菌的分子鑒定

試驗參考文獻[26]的方法，合成目的片段492 bp的特異引物ACT1(5′→3′)：CACGATACATGGCTTATGC和ACT2(5′→3′)：GTTTCTCCACCACACTCCG。同時參考Rees-George等[27]的介紹，設計目的片段280 bp的特異引物PsaF1(5′→3′)：TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT和PsaR2(5′→3′)：CACGCACCCTTCAATCAGGATG。

反應體系總體積25 μL：1)無菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL，DNA 1.0 μL， 引物ACT1、 ACT2 各1.0 μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，34個循環(huán)；72℃再延伸5 min[1]。2)其中無菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL， DNA 1.0 μL，引物PsaF1、PsaR2 各1.0 μL。PCR擴增反應程序為：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min[1]。分別對其PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.5 掃描電子顯微鏡制樣

使用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)3次清洗戊二醛中固定的葉片樣品；分別使用30%、50%、70%、90%及100%乙醇對樣品進行梯度脫水，各15 min；脫水后將樣品置換至丙酮中進行CO2臨界點干燥，干燥操作參考南京覃思科技有限公司K850臨界點干燥儀操作規(guī)程。干燥后將樣品通過碳導電膠帶固定于樣品臺上進行鍍膜上鏡觀察。試驗的處理和操作參考實驗室前期方法[28]，該試驗于華中農業(yè)大學實驗室公共平臺進行。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃潰瘍病發(fā)病規(guī)律

安徽省安慶市岳西縣主簿鎮(zhèn)，獼猴桃種植發(fā)展于20世紀80年代，主栽品種為‘金豐’‘金魁’等中華獼猴桃品種，自首次發(fā)現(xiàn)潰瘍病以來已30年左右；安徽省六安市金寨縣，2012年開始發(fā)展獼猴桃，品種主要是‘紅陽’‘東紅’等中華獼猴桃品種，2013年少數(shù)果苗開始出現(xiàn)感病癥狀，次年擴散至枝條，部分園區(qū)第三年開始發(fā)病。獼猴桃潰瘍病發(fā)病初期主要癥狀為葉片有褐色斑點，外圍有黃色暈圈，后病斑擴大顏色加深，嚴重者可擴散至枝條，表現(xiàn)為皮層和髓部變褐，流出初期為白色，后變?yōu)殍F銹色黏液，但根系一般不表現(xiàn)出感染癥狀(圖1)。鑒于上述兩個地區(qū)具有中國獼猴桃潰瘍病發(fā)生和發(fā)展的典型特征(老園區(qū)和新建園區(qū))，我們自2012—2017年來對上述兩個地區(qū)進行持續(xù)監(jiān)測，擬分析獼猴桃潰瘍病田間全年發(fā)病規(guī)律。研究結果顯示，潰瘍病在安徽上述兩地區(qū)表現(xiàn)為春季和秋季兩次發(fā)病高峰，分別為3—4月份和10—11月份，春季發(fā)病率高于秋季，對于幼苗期獼猴桃，葉片發(fā)病率高于枝條。當上述兩個地區(qū)的最高溫度達25℃以上時，潰瘍病病菌的活動明顯減弱，成潛伏狀態(tài)。上述規(guī)律提示葉片是潰瘍病主要的初侵染部位，而找尋病菌的潛伏部位將成為潰瘍病控制的關鍵。

A: 田間感病植株；B: 葉片出現(xiàn)黃色暈圈現(xiàn)象；C: 新稍感病初期；D: 葉片萎蔫現(xiàn)象；E: 側枝組織變色；F: 主枝組織變色；G: 主蔓組織變色；H: 主蔓感病后期紅色分泌物；I: 植株底部組織變色。紅色箭頭表示部分發(fā)病區(qū)域

圖1獼猴桃潰瘍病田間典型病癥

Figure 1 The typical symptoms of bacterial canker of kiwifruit in the orchard

2.2 潰瘍病形態(tài)學鑒定

為了分析潰瘍病病菌的潛伏部位，通過SS培養(yǎng)基培養(yǎng)后使用透視顯微鏡進行形態(tài)學初步篩選，從而確定疑似Psa菌株。該菌株再次通過KB培養(yǎng)基上純化后，對其菌落進行形態(tài)學觀察篩選，并且與對照組7285和JF8菌株外觀形態(tài)進行觀察比較(圖2)。通過該方法，我們從2013年4月的金寨地區(qū)‘紅陽’獼猴桃葉片樣品中成功確定并分離到潰瘍病菌30株。同時，葉片和枝條的Psa分離鑒定結果顯示，與潰瘍病在春季和秋季兩次發(fā)病高峰一致，Psa在安徽金寨和岳西兩地區(qū)也表現(xiàn)為春季和秋季兩次增殖高峰，而冬、夏季節(jié)Psa分布較少(圖3)。從潰瘍病形態(tài)學角度初步確定潰瘍病病菌在田間植株各部位的分布，可節(jié)約鑒定時間，并為后續(xù)的PCR特異性引物檢測奠定基礎。

2.3 PCR檢測結果分析

基于Koh等[26]和Rees-George等[27]開發(fā)的丁香假單胞菌獼猴桃致病變種特異性鑒定引物，通過凝膠成像系統(tǒng)的結果顯示：若產物在ACT1/ACT2引物擴增下492 bp處有條帶，Psa F1/Psa R2引物擴增下280 bp處有條帶，則初步判斷為Psa菌株，為陽性；結合2.2潰瘍病形態(tài)學鑒定結果，若在特定區(qū)域無條帶出現(xiàn)則表明在本次檢測中未發(fā)現(xiàn)潰瘍病菌株，為陰性。結果顯示，獼猴桃潰瘍病菌在田間主要分布于地上部分的葉片、新稍、側枝、主枝和主蔓中，表土和根系分布較低，只在岳西根際土壤中分離出潰瘍病菌(表1)。

表1 Psa特異性引物ACT1/ACT2和PsaF1/PsaR2檢測結果

CK：空白對照；J-：金寨；Y-：岳西；-1、-2、-3：為3次重復試驗；ZM：主蔓；ZZ：主枝；CZ：側枝；XS：新稍；YP：葉片；GJTR：根際土壤；BT：表土；GX：根系；JF-8：標準獼猴桃潰瘍病菌株；“+”：有條帶；“-”：無條帶

A：潰瘍病致病基因型Psa-V菌株7285(2 mm)；B：JF8(Psa-V) (2 mm)；C：田間純化潰瘍病菌落(2 mm)

圖2獼猴桃潰瘍病菌菌落(KB)形態(tài)

Figure 2Pseudomonassyringaepv.actinidiaecolonies (KB) morphology

圖3 不同時間獼猴桃葉片和枝條的Psa分布

2.4 潰瘍病病部組織結構掃描電子顯微鏡觀察

在自然狀態(tài)下，植株的葉片往往會受到外界不同程度的傷害。我們的前期結果提示葉片是潰瘍病主要的初侵染部位，而且，文獻報道，風雨和傷口是潰瘍病傳播的主要影響因素和途徑。因此本研究主要針對田間植株葉片組織結構進行掃描電子顯微鏡觀察(圖4)。結果顯示，與正常葉片組織比較(圖4-A)，獼猴桃植株葉片在感病過程中，菌株在葉片呈不均勻分布，感病葉片的傷口處的菌株含量遠大于感病葉片的完好區(qū)域(圖4-B、C、D)，說明當葉片被菌株侵染后，尤其在傷口處菌株能大量繁殖，導致葉片會出現(xiàn)相應的病斑。因此，在自然狀態(tài)下，減少對植株部位的傷害可以

A：正常植株葉片(10 μm，×1000)；B：植株感病葉片(10 μm，×1000)；C：感病葉片傷口處(10 μm，×1000)D: 葉片傷口處(10 μm，×2000)

圖4潰瘍病病部葉片組織結構掃描電子顯微鏡觀察

Figure 4 Observation of leaf tissue structure ofPseudomonassyringaepv.actinidiaeby scanning electron microscopy

有效地降低病菌的侵染率。

3 討論與結論

當今獼猴桃潰瘍病已經嚴重影響到我國乃至全球獼猴桃產業(yè)的有效發(fā)展。目前，獼猴桃潰瘍病主要發(fā)生并危害中華和美味獼猴桃的花蕾、葉片、主蔓和枝蔓，軟棗獼猴桃中潰瘍病只在葉片中表現(xiàn)出癥狀，對于植物生長沒有明顯影響[23]。新西蘭學者發(fā)現(xiàn)中華和美味獼猴桃的雄花花粉可以有效傳播獼猴桃潰瘍病[24]，獼猴桃果實和根部未明顯呈現(xiàn)潰瘍病癥狀，因此園區(qū)的潰瘍病感染不會對果實的銷售造成影響，但是潰瘍病對獼猴桃的品質和貯藏性能影響較大[23]。最近，我們研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍病發(fā)病園區(qū)中的狗尾巴草、空心蓮子草和泡桐中具有類似潰瘍癥狀，通過分離可以獲得獼猴桃潰瘍病菌株，證實上述3種植物具有中間寄主的能力[23]。然而，針對獼猴桃潰瘍病菌在自然環(huán)境下田間植株不同部位分布及其侵染后傳播規(guī)律，以及土壤等潛在初侵染源的研究較少，而明確獼猴桃潰瘍病菌在田間感病植株上的分布及其侵染后的傳播規(guī)律對其防治具有重要意義。

本試驗基于Koh等[26]和Rees-George等[27]開發(fā)的丁香假單胞菌獼猴桃致病變種特異性鑒定引物，利用分離的方法以及標準獼猴桃潰瘍病致病基因型Psa-V菌株7285和本實驗室中基因組測序的潰瘍病菌株JF8為對照，形態(tài)學篩選后，以菌株DNA和土壤DNA為模板，使用PCR分子檢測方法對于潛在的初/再侵染源進行鑒定。結果顯示潰瘍病菌株主要寄生于發(fā)病植株的主蔓、主枝、側枝、新稍和葉片，而根際土壤、表土和根系等可以直接或間接接觸潰瘍病菌株的園區(qū)場所，極少發(fā)現(xiàn)有潰瘍病的存在，說明獼猴桃潰瘍病菌株一方面離開獼猴桃組織后生存能力就會受到影響，這與黃其玲等[29]研究發(fā)現(xiàn)根系GFPuv標記獼猴桃潰瘍病菌灌根處理后潰瘍病菌株的數(shù)量會逐漸減少，在沒有滅菌的土壤中，獼猴桃潰瘍病菌冬季和夏季在土壤中的存活時間不超過30 d的結果一致。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃植株葉片在感病過程中，菌株在葉片呈不均勻分布，感病葉片的傷口處的菌株含量遠大于感病葉片的完好區(qū)域。由此可見，活體或獼猴桃衰亡組織才是獼猴桃潰瘍病菌的主要寄生場所，同時狗尾巴草、空心蓮子草和泡桐等園區(qū)其他植物作為中間寄主和初/再侵染來源可能在獼猴桃潰瘍病菌的傳播和蔓延過程中起到了不可替代的作用[23]。感病中華和美味獼猴桃的雄株花粉則是感病園區(qū)獼猴桃潰瘍病快速擴散的主要潛在途徑[30]。不同時間點Psa分離鑒定結果顯示潰瘍病在安徽金寨和岳西兩地區(qū)表現(xiàn)為春季和秋季兩次發(fā)病高峰，冬夏分布較少，潰瘍病菌初期僅感染葉片，隨病情加重，病菌擴散至其他組織。上述研究結果顯示對于初發(fā)生獼猴桃潰瘍病的園區(qū)，及時鏟除病組織或從地上部位鏟除枝組以及減少植株傷口，可以有效控制獼猴桃潰瘍病的進一步發(fā)生和蔓延。

本研究一定程度上解釋了為什么獼猴桃潰瘍病的感病園區(qū)難以完全控制的原因。但是現(xiàn)有資料還沒能完全解釋潰瘍病的主要越冬場所和初/再侵染來源，鑒于此，本研究對發(fā)病園區(qū)可能的初侵染源獼猴桃潰瘍病感病植株的不同部位進行了鑒定(由于花粉和部分園區(qū)雜草被鑒定是可以傳播潰瘍病的中間介質，是潰瘍病發(fā)生的傳染源，果實一般成熟后通過收獲方式離開園區(qū)，不會成為傳染源，本文未涉及)，通過對獼猴桃潰瘍病園區(qū)感病植株的不同部位(包括根際和土壤)進行檢測可以揭示獼猴桃潰瘍病主要侵染和寄生的部位，而獼猴桃潰瘍病的主要分布部位一般是初/再侵染源，上述研究分析為獼猴桃潰瘍病的防治奠定了基礎。