李俊瑩， 武倫鵬， 康辰凱， 付 玉

(1. 鞍山師范學院 化學與生命科學學院， 鞍山 114007； 2. 國家參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心， 延吉 133002)

人參系五加科人參屬植物(PanaxginsengC.A. Mayer)，被稱為“百草之王”，是中國東北三寶之一。人參與西洋參、三七等是近親，是我國傳統(tǒng)的名貴藥材，據(jù)記載已有4000多年的使用歷史。人參皂苷是人參中起主要藥理學活性的物質(zhì)。不同的人參皂苷，顯示出的性質(zhì)和功能也存在較大差異。研究表明，人參稀有皂苷能夠?qū)?nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等都有重要的藥理作用[1-7]。其中，人參稀有皂苷Rg3主要作用于細胞增殖周期的G2/M期，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移，對肺癌、黑色素瘤和肝癌細胞等有明顯抑制作用[8-13]。

雖然稀有人參皂苷具有很強的抗腫瘤活性，但這些皂苷天然含量極低，如人參皂苷Rg3在白參中的含量僅為0.000 3%，在紅參中的含量約為0.03%，而Rh2在天然人參中并不存在，僅在紅參中含有約0.001%。因此，從人參中直接提取這些抗腫瘤稀有皂苷顯然不符合實際。目前，制備稀有人參皂苷的方法主要有化學法和生物轉(zhuǎn)化法，相對于污染環(huán)境、專一性差的化學法，環(huán)境友好、專一性強的生物轉(zhuǎn)化法表現(xiàn)出了更強的競爭力。

內(nèi)生菌是一類存在于植物組織中而不引起侵染癥狀的重要微生物資源。在地球已知的接近30種高等植物中，每個物種都與多種內(nèi)生菌共生[14]。早在100多年前，植物內(nèi)生微生物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。但長期以來，內(nèi)生菌的存在一直被忽略。直到20世紀30年代，由于牲畜食用了感染內(nèi)生真菌的牧草引發(fā)中毒，帶來畜牧業(yè)嚴重損失后，植物內(nèi)生菌才作為一種新的微生物受到了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。內(nèi)生菌不僅在生物防治和促進增長寄主植物等方面顯示很強的生態(tài)功能[15-17]，也在分解有機物方面表現(xiàn)出強大的功能[18]。

Park等[19-20]從1～4年生人參根部分離鑒定了200多種人參內(nèi)生真菌并對其多樣性進行了分析；Wu等從遼東楤木(Araliaelata)根中分離到能夠產(chǎn)生三萜人參皂苷Rb2和Re的內(nèi)生真菌[21]，他們還從15年生人參根部中分離得到產(chǎn)生人參主皂苷Rb2和Rc的內(nèi)生菌[22]。Cho等[23]從5年生園參根中分離出36種人參內(nèi)生細菌并經(jīng)行了鑒定，其中有3種內(nèi)生菌對立枯絲核菌有抑制作用。姜云等[24]利用研磨法和組織塊法對4年生人參根、莖、葉不同器官中共分離獲得152株內(nèi)生細菌和46株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)有3種菌對灰霉病有明顯的抑制作用。曲紅光等[25]分離了6年生人參內(nèi)生細菌18株，其中有3株內(nèi)生細菌代謝產(chǎn)物粗提物對人宮頸癌細胞Hela具有較好的抗腫瘤活性。林星辰等[26]利用人參內(nèi)生菌B69菌株抑制人參根腐病。目前，對人參內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生菌的分離、代謝產(chǎn)物的抗癌及拮抗作用方面，關(guān)于人參內(nèi)生菌微生物轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷的研究很少。崔磊等[27]利用黨參內(nèi)生菌D19轉(zhuǎn)化人參根總皂苷為稀有人參皂苷F2和C-K；郭從亮等[28]利用一種植物內(nèi)生菌Coniochaetasp.對三七總皂苷中人參皂苷Rb1進行了特異性轉(zhuǎn)化。本課題組前期從17年生野山參中分離、篩選獲得一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的內(nèi)生真菌Burkholderiasp. GE 17-7，本研究旨在研究其轉(zhuǎn)化原人參二醇型和原三醇型人參主皂苷，探討其水解人參主皂苷制備稀有皂苷Rg3的特異性。

1材料與方法

1.1實驗材料

菌株Burkholderiasp. GE 17-7由17年生的鮮人參根分離得到，目前由延邊大學分析測試中心尹成日課題組保藏并提供，具體分離方法參照文獻[29]；人參標準品20(S)-Rb1、20(S)-Rb2、20(S)-Rc、20(S)-Rd、20(S)-Re、20(S)-Rg1、20(S)-Rg2、20(S)-Rg3、20(S)-Rh1、F1和C-K采購自成都曼思特生物科技有限公司；薄層層析板Silica gel60-F254購自德國Merck公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽購自美國Sigma公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)購自美國TEDIA公司；其他試劑及藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2菌株Burkholderia sp. GE 17-7的活化

將菌株Burkholderiasp. GE 17-7從凍存管中取出，加入PDB液體培養(yǎng)基中搖培，取100 μL涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，放于30℃下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)后純化，進行下一步實驗。

1.3微生物轉(zhuǎn)化人參主皂苷

菌株Burkholderiasp. GE 17-7放到搖瓶中液體培養(yǎng)，達到生長對數(shù)期后，分別與人參主皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1水溶液按照體積比為1∶1混合，放到30℃的空氣浴振蕩器中150 r/min下培養(yǎng)3 d。每隔5 h取出部分培養(yǎng)液，低溫濃縮后用乙醚溶液萃取，飽和正丁醇處理后旋干，得到了反應(yīng)產(chǎn)物并用薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和核磁共振法(NMR)進行分析。

1.4分析方法

1.4.1TLC色譜條件

材料：硅膠60板；展開劑：氯仿-甲醇-水按體積比為10∶5∶1；顯色劑：10%的硫酸乙醇溶液。通過與標準品的Rf值比對，定性分析樣品中人參皂苷的種類和變化。

1.4.2HPLC色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；柱溫：250℃；洗脫液：水(A)和乙腈(B)進行二元洗脫；梯度條件是：0～13 min，A∶B(77∶23，V/V)；13～33 min，A∶B(46∶54，V/V)；33～45 min，A∶B(32∶68，V/V)；55～60 min，A∶B(0∶100，V/V)；60～63 min，A∶B(77∶23，V/V)。每一個人參皂苷都通過與皂苷標準譜圖的保留時間一一對應(yīng)，其含量主要通過峰面積來計算。

1.4.3NMR條件

利用瑞士Bruke Av 300核磁共振波譜儀對單體皂苷進行核磁共振檢測。探頭：5 mm BBO；溶劑：Pyridine-d5 (氘代吡啶)。進行包括13C NMR檢測。

2結(jié)果與分析

2.1TLC色譜分析結(jié)果

利用人參內(nèi)生菌Burkholderiasp. GE 17-7生物轉(zhuǎn)化原人參二醇型主皂苷[包括20(S)-Rb1、20(S)-Rb2、20(S)-Rc和20(S)-Rd]和原三醇型人參主皂苷[包括20(S)-Re和20(S)-Rg1]。從TLC圖中可以看出，菌株GE 17-7能有效轉(zhuǎn)化原人參二醇型皂苷Rb1和Rd，且終產(chǎn)物為Rg3。菌株GE 17-7對原人參二醇型皂苷20(S)-Rb2和20(S)-Rc、原三醇型人參皂苷20(S)-Re和20(S)-Rg1均無轉(zhuǎn)化效果(圖1)。

S1、S2、S3：人參皂苷標準品

圖1菌株GE 17-7水解人參皂苷Rb1(1)、Rb2(2)、Rc(3)、Rd(4)、Re(5)和Rg1(6)的TLC圖

Figure 1 TLC chromatograms of metabolites of ginsenoside Rb1(1), Rb2(2), Rc(3), Rd(4), Re(5), and Rg1(6) converted by the strain GE 17-7

2.2HPLC色譜分析結(jié)果

從HPLC圖可知，菌株GE 17-7在與人參皂苷Rb1反應(yīng)5 h后，人參皂苷Rb1的峰面積明顯減少，產(chǎn)生與標準品保留時間相同的Rd和Rg3峰(圖2-c)。反應(yīng)15 h后，人參皂苷Rb1和Rd的峰完全消失(圖2-d)。產(chǎn)生的單峰(圖2-c)和人參皂苷標準品Rg3的HPLC譜圖(圖2-a)比對，出峰保留時間相同。說明終產(chǎn)物為人參稀有皂苷Rg3。

a：人參皂苷標準品；b：反應(yīng)底物；c：轉(zhuǎn)化5 h后的產(chǎn)物；d：轉(zhuǎn)化15 h后的產(chǎn)物

圖2菌株GE 17-7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的HPLC的圖

Figure 2 HPLC analysis of metabolites of ginsenoside Rb1 converted by strain GE 17-7

2.3 NMR分析結(jié)果

將HPLC分離出的最終轉(zhuǎn)化產(chǎn)物采用瑞士Bruke Av 300核磁共振波譜儀進行檢測，共出現(xiàn)42個碳信號峰，其中104.9和105.9為兩個糖端基碳信號峰，δ126.2和δ130.6分別為C-24和C-25的雙鍵碳信號峰，與手性碳原子C-20相連接的C-17，C-21和C-22分別出現(xiàn)在δ54.6，26.9和35.7，而其他13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻[30]基本一致，故終產(chǎn)物為人參稀有皂苷20(S)-Rg3。

3討論

人參皂苷是人參的主要活性成分，總皂苷含量約為4%。人參皂苷屬于三萜類皂苷，按其皂苷元的結(jié)構(gòu)不同可分為3種類型：一類是齊墩果烷型，在自然界含量最少；另兩類是達瑪烷型的人參二醇型皂苷(PPD)和人參三醇型皂苷(PPT)。一般人參中人參二醇型皂苷占總皂苷的45%～60%，人參三醇型皂苷占人參皂苷總量的12%～20%，齊墩果酸型皂苷占7%～10%。由于人參二醇型和人參三醇型皂苷占人參皂苷的大多數(shù)，并且人參二醇型皂苷和人參三醇型皂苷內(nèi)含有的皂苷種類比較多，因此目前關(guān)于這兩種類型皂苷的報道很多。

原人參二醇型[20(S)-protopanaxadio1，包括人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2等]和原三醇型人參皂苷[20(S)-protopanaxatrio1，包括人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1等]都屬于四環(huán)三萜達瑪烷型皂苷，不同之處在于二醇型皂苷母核上有3個羥基取代(C3、C12和C20)，成苷的位置主要在C3和C20，糖基多為葡萄糖、阿拉伯糖和木糖；而三醇型皂苷母核上有4個羥基取代(C3、C6、C12和C20)，糖苷鍵主要在C6和C20，糖基多為葡萄糖、鼠李糖和木糖。人參皂苷的結(jié)構(gòu)因糖基側(cè)鏈的不同，顯示出的性質(zhì)和活性也有很大差異[31-35]。

表1 菌株GE 17-7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的代謝產(chǎn)物人參皂苷20(S)-Rg3的13C-NMR數(shù)據(jù)(75 MHz, 溶劑: 氘代吡啶)

結(jié)合圖3原人參二醇型皂苷結(jié)構(gòu)，可以很明確地看出人參內(nèi)生菌Burkholderiasp. GE 17-7未選取底物母核結(jié)構(gòu)為4個羥基取代(C3、C6、C12和C20)的原人參三醇型，而是選取了母核上有3個羥基取代(C3、C12和C20)的原人參二醇型，同時通過菌株GE 17-7對人參皂苷Rb2和Rc的水解結(jié)果，我們就可以看出其只對C-20位上O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖具有水解專一性。菌株GE 17-7將人參皂苷Rb1先水解到C-20位O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd。再水解到C-20位O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷鍵，形成終產(chǎn)物人參皂苷Rg3。轉(zhuǎn)化路徑：人參皂苷Rb1→人參皂苷Rd→人參稀有皂苷Rg3。

GinsenosideR1R2R3Rb1-Glc2-1Glc-Glc6-1Glc-HRb2-Glc2-1Glc-Glc6-1Arap-HRc-Glc2-1Glc-Glc6-1Araf-HRd-Glc2-1Glc-Glc-H20(S)-Rg3-Glc2-1Glc-H-HRh2-Glc-H-HCompound K-H-Glc-HCompoud Y(C-Y)-H-Glc6-1Arap-HM12(PPD)-H-H-HF2-Glc-Glc-H

圖3 20(S)-人參二醇型皂苷的結(jié)構(gòu)

Figure 3 The structure of 20 (S)-panaxadiol ginsenosides

4 結(jié)論

本研究利用從17年生野山參中分離、篩選獲得一株人參內(nèi)生真菌Burkholderiasp. GE 17-7生物轉(zhuǎn)化人參主皂苷。通過薄層色譜法、高效液相色譜法等方法對人參主皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行分離純化，采用波譜解析及理化常數(shù)對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明人參內(nèi)生真菌Burkholderiasp. GE 17-7能夠特異性制備人參稀有皂苷20(S)-Rg3，為工業(yè)制備人參稀有皂苷提供了新的微生物資源。