李慶云（廣州市第一人民醫(yī)院老年病科　廣州　510180）

三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制及HSP70表達(dá)影響的研究△

李慶云（廣州市第一人民醫(yī)院老年病科廣州510180）

目的：探討三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制及HSP70表達(dá)的影響。方法：選擇剛出生的SD大鼠作心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及缺氧/復(fù)氧模型。將原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞分為5組，A組為對(duì)照組；B組為缺氧/復(fù)氧對(duì)照組；C組為三七二醇低濃度組，D組為三七二醇中濃度組，E組為三七二醇高濃度組。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP70的表達(dá)，用生化比色法檢測(cè)LDH活力。結(jié)果：三七二醇對(duì)SD大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用，保護(hù)作用與三七二醇濃度有關(guān)。隨著三七二醇濃度增加，缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)增加，同時(shí)隨時(shí)間延長(zhǎng)，SD大鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)增加。結(jié)論：三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞保護(hù)作用可能與HSP70表達(dá)增加有關(guān)。不同濃度的三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)均起一定作用。

三七二醇 缺氧/復(fù)氧 心肌細(xì)胞 熱休克蛋白70

三七二醇具有降低腦血管阻力，增加頸內(nèi)動(dòng)脈血流量，抑制ADP、AA、PAF和凝血酶誘導(dǎo)的人體血小板聚集，降低血黏度和抑制血栓形成，改善微循環(huán)，改善腦缺血、腦梗塞引起的功能和行為障礙的功效。HSP70是熱休克蛋白中的一種，可被多種刺激誘導(dǎo)，它與心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)系密切，被廣泛應(yīng)用于心肌缺血再灌注損傷內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的研究。本研究選擇剛出生SD大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，觀察三七二醇對(duì)其保護(hù)作用及HSP70表達(dá)的影響。

1　材料和方法

1.1主要材料：選擇剛出生1～3d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限。不同濃度的三七二醇皂苷。

1.2方法：原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)：用改良Harary［1］方法制備乳鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)，3d后用0.25%胰酶消化用于傳代。將蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種1×105/孔，作細(xì)胞爬片。隔天換含20%無(wú)血清低糖的DMEM培養(yǎng)液，3d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3心肌細(xì)胞模型的建立方法：正常對(duì)照組（C組）細(xì)胞不經(jīng)任何處理，持續(xù)培養(yǎng)50h。心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的制備主要參照Webester［2］方法進(jìn)行。預(yù)先培養(yǎng)1h；去掉培養(yǎng)液，加入預(yù)先用N2飽和的D-Hankcs液，置于無(wú)菌密閉容器，在恒溫水浴箱內(nèi)保持37℃，進(jìn)氣口通入95%N2+5%CO2混合氣體，經(jīng)出氣口流出，使容器內(nèi)保持無(wú)氧狀態(tài)2h；將D-Hankcs液換成含20%無(wú)血清低糖的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞放回37℃，5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4實(shí)驗(yàn)分組：將原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞分為5組，A組為對(duì)照組；B組為缺氧/復(fù)氧對(duì)照組；C組為三七二醇低濃度組，D組為三七二醇中濃度組，E組為三七二醇高濃度組。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP70的表達(dá)，用生化比色法檢測(cè)LDH活力。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH漏出的影響見表1。

表1　三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH漏出的影響（±s）

表1　三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH漏出的影響（±s）

組別　例數(shù)　LDH活力A B C D E 20 20 20 20 20 689.3±43.3 734.2±74.4*713.4±29.8☉634.5±57.7☉647.4±52.3☉

與I組比較，*P＜0.05；與II組比較，☉P＜0.05。

三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH漏出的影響與A組相比，心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后LDH釋放明顯增加（P＜0.05），表明心肌細(xì)胞受到缺氧/復(fù)氧損傷。加入不同濃度的三七二醇后，心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷得到不同程度減輕，與B組相比C、D、E 組LDH釋放顯著減少（P＜0.05），高濃度三七二醇比低濃度三七二醇保護(hù)作用強(qiáng)。

2.2三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)的影響：用顯微鏡觀察，不難看出正常心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)量非常少，有的幾乎不表達(dá)；但缺氧/復(fù)氧損傷一旦發(fā)生，心肌細(xì)胞中HSP70表達(dá)增多（主要在胞漿內(nèi)表達(dá)）。不同的缺氧/復(fù)氧時(shí)間，HSP70表達(dá)不同，缺氧/復(fù)氧0h，細(xì)胞中HSP70表達(dá)很少，幾乎不表達(dá)。缺氧/復(fù)氧2h、4h、12h、24h，與A、B組相比，可見細(xì)胞中HSP70明增多。

3　討論

熱休克蛋白70（HSP70）具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗氧化損傷、分子伴侶［3］、細(xì)胞調(diào)節(jié)、ATP酶作用及參與細(xì)胞骨架的形成與修復(fù)等功能，尤其值得關(guān)注的是其具有的心肌保護(hù)作用和參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控［4］，能縮小心肌缺血壞死范圍、保護(hù)心肌收縮力、抗心律失常［5］。本研究發(fā)現(xiàn)三七二醇對(duì)SD大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用，保護(hù)作用與三七二醇濃度有關(guān)。隨著三七二醇濃度增加，缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)增加，同時(shí)隨時(shí)間延長(zhǎng)，SD大鼠缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)增加。不同濃度的三七二醇對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)均起一定作用。

［1］Harary I，Barbara F.In vitrostudies of single isolated beatingheart cells［J］.Science，1960，31：1674-1657.

［2］Webester KW，Discher DJ，Bishopric NH.Cardioprotection in anin citro model of hypocic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，1995，27：453-458.

［3］Knowlton AA.The role of heat shock proteins in the heart［J］.Jmol Cell Cardiol，1995，27（1）：121-131.

［4］Suzuki k，Sawa Y，Kagisaki K，et al.Reductioninmyocardialapoptosis associated with overexpression of heat protein 70［J］. Basic Res Cardiol，2000，95：397-403.

［5］Gusarova V，Cap lan AJ，Brodsky JL，et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecularchaperonesHSP90andHSP70［J］.BiolChem，2001，276（27）：24891-24897.

△本文章是結(jié)題論文，項(xiàng)目編號(hào)：20121A011016。

R542.2+2

B

1672-8351（2016）02-0135-01