張 婧，王玉銀，，魏文悅，郭敏芳，楊德兵，馬存根，*，尉杰忠，3*

（1.山西中醫(yī)藥大學神經(jīng)生物學研究中心，山西太原 030024;2.山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009;3.山西大同大學附屬第一醫(yī)院，山西大同 037009）

許多研究表明小膠質細胞在阿爾茨海默病(Al?zheimer disease，AD)等多種認知功能障礙的疾病過程中發(fā)揮重要作用。小膠質細胞通過吞噬清除和提供營養(yǎng)來維持腦內穩(wěn)態(tài)平衡。激活的小膠質細胞具有2種完全相反的狀態(tài)及機制[1]：一方面小膠質細胞會產生大量的促炎因子如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleu?kin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）等，并產生活性氧ROS和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）從而損害神經(jīng)元和大腦組織；另一方面小膠質細胞會在腦內清除吞噬Aβ，減少神經(jīng)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護的作用[2]。因此，小膠質細胞最近已經(jīng)成為AD發(fā)病機制研究中的關鍵角色。

研究表明法舒地爾（fasudil）可減輕免疫炎癥反應，恢復神經(jīng)功能，改善AD疾病模型的學習認知能力[3]，還可以促進神經(jīng)元再生，減少腦內Aβ-42的生成[4]，通過側腦室注射還可促進錐體突觸伸長[5]。

基于以上研究，我們通過脂多糖（LPS）激活原代小膠質細胞來研究法舒地爾對細胞炎癥水平的影響，以及對Aβ的吞噬作用，并研究其可能的作用機制。結果發(fā)現(xiàn)法舒地爾可以降低原代小膠質細胞的促炎因子水平，提高原代小膠質細胞的Aβ吞噬能力，下調小膠質細胞HIF-1α的轉錄活性來降低糖酵解過程相關酶的相對表達量，抑制糖酵解的過程，從而增加ATP的產生，提示法舒地爾是治療AD的潛在藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

原代小膠質細胞由山西大同大學腦科學研究所分離培養(yǎng)。DMEM(Gibco)培養(yǎng)基購自Life Tech?nologies Corporation，胰酶及胎牛血清購自Biologi?cal Industries，鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，蛋白酶抑制劑cocktail購自Selleck公司，Aβ（6E10）抗體購自Covance（SIG-39320），RNA提取試劑Trizol reagent購自Thermal，One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super?mix購自全式金生物技術有限公司，染料法熒光定量PCR試劑盒ultra SYBR MIX(with ROX)購自康為世紀生物技術有限公司，ATP試劑盒CellTiter-Glo@ Luminescent Cell Viability Assay購自Pro?mega。PCR引物由primer bank以及在線Primer 3.0軟件設計并訂購于Life Technologies公司。

1.2 原代細胞培養(yǎng)

新生小鼠（出生后1～3d）剝離出大腦內海馬組織，剪碎后轉移到培養(yǎng)皿，加入0.25%胰蛋白酶（BI）和10 μL DNAse I (10 mg/mL），置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱消化20 min后，加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和，4 ℃800 r/ min離心5 min。棄上清，加入1 mL原代培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞稀釋后種到包被的培養(yǎng)皿中每3 d更換1次培養(yǎng)基，敲除下來即為的原代小膠質細胞。

1.3 細胞外ATP檢測

實驗前1 d將敲下來的原代小膠質細胞種到96孔細胞培養(yǎng)板，細胞密度介于50%～70%。細胞貼壁后，于檢測前12 h將LPS及法舒地爾加入細胞內。在檢測時間每孔取25 μL PBS加入25 μL ATP檢測試劑，棄上清，按照試劑盒操作將配置好的工作液加入96孔板內，靜置10 min。上清轉移至白板用酶標儀檢測，然后棄所有上清，細胞加入50 μL細胞裂解液提取蛋白?？侫TP量比總蛋白量得到細胞分泌ATP的能力。

1.4 細胞Aβ吞噬實驗

實驗前1 d將敲下來的原代小膠質細胞種到96孔避光黑色細胞培養(yǎng)板，細胞密度介于50%～70%，并將Aβ單倍體放置于37 ℃搖床寡聚過夜。按設置時間加入藥物，于檢測前4 h將Aβ寡聚體加入，在檢測時間吸出上清，加入100 μL PBS后用酶標儀檢測發(fā)光度。Cyto D為陰性對照，而NaR為陽性對照[6]。

1.5 熒光定量PCR

取1 mg RNA作為模板，反轉錄按One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix進行PCR擴增，定量反應在熒光定量PCR儀上進行。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism 7.0統(tǒng)計軟件進行處理。檢測指標多組間比較采用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用Dunnett’sT檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 研究結果

2.1 法舒地爾對LPS刺激的原代小膠質細胞炎癥水平的影響

結果顯示，與對照組相比,經(jīng)過10 μg/mL法舒地爾處理后，iNOS在LPS刺激6、12 h后的mRNA表達水平明顯下降，同時TNF-α在LPS刺激3 h時表達水平下降最為顯著，而IL-6的整體mRNA表達水平均明顯下降，見圖1。

圖1 經(jīng)法舒地爾處理后的原代小膠質細胞在LPS刺激下促炎因子變化

2.2 法舒地爾對原代小膠質細胞Aβ吞噬作用的影響

研究表明，在原代小膠質細胞經(jīng)過不同濃度的法舒地爾處理后，與對照組相比，法舒地爾濃度為5 μg/mL時增加最顯著，而法舒地爾濃度為10 μg/mL時Aβ吞噬能力有明顯增加，見圖2。

圖2 原代小膠質細胞在不同濃度的藥物處理后Aβ吞噬量變化

2.3 法舒地爾對原代小膠質細胞新陳代謝功能的影響

結果顯示，在藥物處理后，與空白對照組相比，法舒地爾濃度為10 μg/mL時的總ATP量與總蛋白量的比值明顯升高，法舒地爾濃度為5 μg/ mL時增加最為顯著（圖3）。而在10 μg/mL法舒地爾處理后，糖酵解過程的相關酶己糖激酶1(HK1)、丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、乳酸脫氫酶(LDHA)以及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的mRNA表達水平均有不同程度的下降，其中以HK1和PGK1的下降最為顯著，見圖4。

圖3 在不同藥物濃度下原代小膠質細胞總ATP產量

圖4 原代小膠質細胞在法舒地爾處理、LPS刺激后糖酵解相關酶的mRNA變化

3 討論

免疫系統(tǒng)介導的神經(jīng)炎癥在AD中發(fā)揮著巨大的作用[8]。我們首先構建細胞炎癥模型，激活原代小膠質細胞。研究發(fā)現(xiàn)用法舒地爾處理后激活原代小膠質細胞明顯使促炎因子IL-6、TNF-α和iNOS表達水平下降。這表明，法舒地爾在原代小膠質細胞激活后，減少了炎癥反應。法舒地爾還可以顯著促進原代小膠質細胞的吞噬作用，并可能通過這一途徑減少腦內Aβ，成為治療AD的潛在藥物。

研究表明維持小膠質細胞的新陳代謝，對清除Aβ至關重要[9-10]。我們觀察了藥物對原代小膠質細胞代謝功能的影響，結果顯示原代小膠細胞在經(jīng)過不同濃度的法舒地爾處理后，細胞分泌ATP的能力明顯增加，說明加入藥物后細胞新陳代謝能力明顯增加。我們進一步用脂多糖（LPS）刺激原代小膠質細胞來構建細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)小膠質細胞糖酵解過程的相關酶HK1、PDK1、PGK1、LDHA以及HIF-1α的mRNA水平均有不同程度的下調，說明小膠質細胞的糖酵解過程明顯減少。有研究顯示NFκB信號通路的活化可上調HIF-1α的轉錄活性[7]。HIF-1α被報道是細胞能量代謝的關鍵調控因子，而高表達的HIF-1α能夠激活糖酵解相關酶的轉錄水平[11]，因此HIF-1α減少可以減少糖酵解相關酶的激活從而減弱糖酵解過程。小膠質細胞是腦內固有免疫細胞，而體內免疫細胞介導炎癥反應主要通過糖酵解提供能量[12]。我們的研究結果表明法舒地爾能使小膠質細胞的糖酵解過程明顯減少，從而減少細胞炎癥的能量供給使LPS刺激的原代小膠質細胞內的炎癥水平下降。

總之，我們的研究表明法舒地爾可能通過下調小膠質細胞HIF-1α的轉錄活性來降低糖酵解過程相關酶的表達，抑制糖酵解過程從而增加ATP的產生，從而維持小膠質細胞的新陳代謝來減輕炎癥反應，增加吞噬作用。