譚苑芬，梁文能

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿屬植物EpimediumL.，主要來(lái)源于淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim，箭葉淫羊藿EpimediumsagittatumMaxim，柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.Sying和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumMaxim的干燥葉。淫羊藿味甘、性溫，入肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕作用，臨床主要用于腎虛陽(yáng)痿、尿頻、筋骨痿軟及風(fēng)寒濕痹等證[1-3]。目前對(duì)淫羊藿的研究主要在于其化學(xué)成分的測(cè)定[4-5]和淫羊藿苷的含量測(cè)定[6-9]。淫羊藿苷為評(píng)價(jià)淫羊藿質(zhì)量的指標(biāo)性成分，具有提高人體免疫力、改善心血管功能、增加性腺功能、抗腫瘤、抗炎、補(bǔ)肝腎等功效[10-11]。本研究中參考文獻(xiàn) [12-14] 建立了測(cè)定不同采收期柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的高效液相色譜法，并分析了淫羊藿藥材的最佳采收時(shí)間。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），含四元洗脫泵、全自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；BSA124S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KG-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿對(duì)照品（批號(hào)為 110737-201416，純度為94.2%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。柔毛淫羊藿藥材于2016年8月至2017年7月采收于甘肅省隴南市，經(jīng)黃昌杰副主任藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿屬Epimedium柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，采集植物均為生長(zhǎng)2～3葉的植株，同一顆植物每月采收1次，連續(xù)采集12個(gè)月，以此編號(hào)為1～12，具體采收時(shí)間見(jiàn)表1，采收后均置陰涼通風(fēng)房間陰干，除去雜質(zhì)，備用。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 不同采收期的淫羊藿藥材質(zhì)量

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稱取淫羊藿苷對(duì)照品11.68mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為對(duì)照品貯備溶液，精密吸取5 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇定容，得每1 mL含淫羊藿苷58.40 μg的對(duì)照品溶液。取采摘陰干的藥材樣品（序號(hào)為10），粉碎，過(guò)4號(hào)篩，稱取粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)不低于5 000，分離度大于1.5，分離良好。

圖1 柔毛淫羊藿高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，2，5，10，20 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2.950X+4.127，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在58.40～1 168.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣 1，5，20 μL，每個(gè)體積連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為2.37%，1.06%，0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：室溫下取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別在放置 0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)考察24 h，記錄淫羊藿苷色譜峰面積。結(jié)果的RSD為2.32%（n=7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品（序號(hào)為10），依法同時(shí)制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定淫羊藿苷含量。結(jié)果的RSD為0.98%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的藥材樣品粉末0.25 g，精密稱定，共6份，另精密量取對(duì)照品溶液10.12 mg，置 10 mL容量瓶中（每 1 mL含淫羊藿苷1.012 mg），分別精密量取1 mL，加入上述6份樣品中，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取前述不同時(shí)期采摘的藥材樣品，依法制備供試品溶液，各平行制備2份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算淫羊藿苷含量，測(cè)定結(jié)果按干燥品計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

表3 不同采收期淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果（%）

圖2 不同采收期淫羊藿苷含量折線圖

3 討論

3.1 供試品溶液制備

試驗(yàn)前先用正交試驗(yàn)考察了不同溶劑（甲醇、乙醇、稀乙醇）和不同提取方式（超聲、回流、索氏提取）對(duì)柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用稀乙醇作為提取溶劑時(shí)，回流提取和索氏提取的淫羊藿苷含量均高于超聲提取，索氏提取所用溶劑較少，提取效率高，但回流提取簡(jiǎn)單易操作，且和藥典的提取溶劑一致。因此，本試驗(yàn)中選擇稀乙醇為提取溶劑回流提取1 h作為供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件選擇

本試驗(yàn)中參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》淫羊藿藥材[15]項(xiàng)下含量測(cè)定條件，首先對(duì)流動(dòng)相的組成和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，采用DAD對(duì)淫羊藿苷對(duì)照品溶液在200～400 nm內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此本試驗(yàn)中選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。同時(shí)比較了以乙腈 -水，甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%溶液醋酸分別作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用藥典中所載乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，供試品溶液中淫羊藿苷的色譜峰有拖尾現(xiàn)象，且分離度不好，有干擾；而采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，供試品溶液中淫羊藿苷的色譜峰峰形良好，拖尾減少，對(duì)稱因子為1.01，理論板數(shù)高，無(wú)其他色譜峰干擾。因此，試驗(yàn)確定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

3.3 最佳采收期分析

本研究結(jié)果顯示，不同時(shí)期采收的柔毛淫羊藿藥材中淫羊藿苷含量差異較大，7月采收的含量最高（可達(dá)0.723 9%），8月后含量開(kāi)始降低，2月含量最低（0.223 5%）。根據(jù)《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，淫羊藿苷是評(píng)價(jià)和控制淫羊藿藥材的重要指標(biāo)，而不同時(shí)期采收的淫羊藿藥材對(duì)其臨床使用有一定影響。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，柔毛淫羊藿的最佳采收期為每年7月，此時(shí)采收的藥材能最大限度地保證藥效，這可為開(kāi)發(fā)淫羊藿藥材的利用價(jià)值提供參考。