辛 茜， 陳德經(jīng),2*， 夏冬輝， 楊 慧， 金文剛,2， 賈少杰， 賀屹潮

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000； 2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000； 3.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

中國大鯢(AndriasdavidianusBlanchard)屬大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，屬國家二級保護動物，2017年起大鯢被列入人工繁育國家重點保護水生野生動物名錄，人工繁殖的子二代大鯢允許加工和利用[1]。大鯢體表多皮膚腺，受到微生物感染、外界壓力或電刺激時，會分泌一種具有特殊性氣味的白色黏稠狀黏液，該黏液含有黏糖蛋白、低聚糖肽、無機鹽以及“蛙皮素”等生物活性成分，具有抗菌[2-3]、抗腫瘤[4]等藥理作用。徐偉良[5]采用MTT法檢測黏液糖蛋白對人肺腺癌細胞A549的抑制增殖作用，發(fā)現(xiàn)大鯢黏液具有良好的殺傷肺癌細胞的作用。黏液在凍成干粉后，其粘附性極強，有較好的生物相容性，并且可降解，也可以作為止血材料[6]、粘合劑[7]及軟組織填充材料等[8]。所以，作為新的“抗生素”藥物和生物粘合劑的大鯢黏液，是目前市場上最具前景的天然醫(yī)用生物粘合材料[9]。在大鯢黏液粉中摻入低成本的土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉，摻入物與大鯢黏液粉很難區(qū)別，但在生物活性以及應(yīng)用價值上相差甚大。因此，如何快速、簡捷、有效地鑒別大鯢黏液粉，成為大鯢黏液合理開發(fā)應(yīng)用的關(guān)鍵。

本文以大鯢黏液粉為鑒別對象，選擇土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉、大鯢皮粉作為摻偽物質(zhì)，分別運用偏最小二乘線性判別法(PLS-DA)和偏最小二乘回歸分析法(PLSR)建立摻偽大鯢黏液粉的定性判別模型和定量分析模型[10]，達到快速鑒別摻偽大鯢黏液粉及預(yù)判摻偽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

大鯢黏液、土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢皮粉、大鯢蛋白粉均由陜西省資源生物重點實驗室自制。

1.1.2 儀器與設(shè)備

VERTEX 70型傅里葉紅外光譜儀，配有OPUS 7.5光譜采集軟件和漫反射積分球附件(德國Bruker)；FA3204B型電子天平(上海精科實業(yè)有限公司)；LGJ-10B型冷凍干燥機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)；BCD-649WE型雙開門冰箱(青島Haier)；DFY-200小型粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；100目不銹鋼標準篩(臨沂市科航實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 方 法

表1 摻偽樣品的配比分布

1.2.1 樣品制備

刺激大鯢收集黏液，用真空凍干機干燥，凍干的黏液研磨成粉末狀過100目篩；土豆淀粉、大鯢蛋白粉，研磨過100目篩。以大鯢黏液粉(A)為基礎(chǔ)，摻入物土豆淀粉(B)、大鯢肉粉(C)、大鯢蛋白粉(D)、大鯢皮粉(E)，共配制4類摻偽樣品。60個純黏液粉樣品和240個摻偽黏液粉樣品，共計300個樣品。樣品質(zhì)量均為0.3 g，稱量誤差不超過0.001 g。置于2 mL的離心管中，旋渦混合器上混勻，樣品的配比方法見表1。

1.2.2 光譜采集

試驗前需先打開機器預(yù)熱30 min左右，然后將樣品放入石英樣品杯中混合均勻，以儀器內(nèi)置背景為參比，采用積分球漫反射方式采集300個樣品的近紅外光譜，所有樣品均重復(fù)采集3次，取其平均值，獲得樣品的平均近紅外光譜。光譜掃描范圍12 500～4000 cm-1，分辨率為8 cm-1。

1.2.3 定性分析

采用MATLAB R2014a分析軟件。將采集的300個光譜進行2分類和5分類的分類建模分析(2分類是將樣品粗分為純樣品和摻偽樣品；5分類將樣品細分為純大鯢黏液粉、摻入物土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉)。采用KS(kennard-Stone)方法選擇240個樣本作為校正集，剩余的60個樣本作為預(yù)測集。采用多元散射校正(MSC)、標準正態(tài)變量變換(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(1SGD)、二階導(dǎo)數(shù)(2SGD)、1SGD+MSC和1SGD+SNV對原始光譜經(jīng)預(yù)處理后，通過比較校正集及預(yù)測集定性判別模型的準確率，來確定定性模型最佳預(yù)處理方法。

1.2.4 定量分析

采用偏最小二乘回歸分析法(PLSR)分別建立摻入不同比例土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉的摻偽大鯢黏液粉的定量分析模型。各類摻偽樣品的總數(shù)均為60個。建模時，每類分別采用KS(kennard-Stone)方法選取42個樣本作為校正集，建立定量校正模型，其余18個樣本作為預(yù)測集，檢驗預(yù)測模型的性能。通過交互驗證均方根誤差(Root mean square error of cross-validation，RMSECV)確定建模所需的主因子數(shù)，對所建模型的質(zhì)量采用校正/預(yù)測相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of calibration/prediction，Rc2/Rp2)、校正均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)和預(yù)測均方根誤差(Root mean square error of prediction，RMSEP)來評價。校正/預(yù)測相關(guān)系數(shù)越大，模型線性相關(guān)性越好；校正均方根誤差與預(yù)測均方根誤差越小，模型擬合、預(yù)測效果越好[11]。定量數(shù)據(jù)處理軟件與定性處理軟件相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 純大鯢黏液粉和摻偽物的平均近紅外光譜

圖1為60個純大鯢黏液粉樣品在12 500～4000 cm-1光譜區(qū)間內(nèi)的平均近紅外光譜圖。由于不同的大鯢黏液粉樣品內(nèi)部化學(xué)成分和組織結(jié)構(gòu)不同，所以光譜的波峰強度會有所差異。在5774、6670、8416 cm-1等處有明顯的特征吸收峰。5774 cm-1是C—H鍵倍頻的倍頻吸收和CH3基團吸收[12],6670 cm-1是N—H鍵的倍頻吸收，8416 cm-1是C—H鍵伸縮振動的二倍倍頻。

圖2是純土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢皮粉、大鯢蛋白粉和大鯢黏液粉的平均近紅外光譜圖。12 500～4000 cm-1區(qū)間信息量豐富,能反映出5種樣品的差異性。在7500～5500、5000～4000 cm-1范圍內(nèi)，土豆淀粉的光譜圖與其他4種樣品的光譜圖差異顯著?？赡苁且驗橥炼沟矸鄣闹饕煞质嵌嗵?，其他4種樣品主要以蛋白質(zhì)為主。大鯢肉粉、大鯢蛋白粉、大鯢皮粉和大鯢黏液粉的光譜盡管趨勢相同，但在相同的波長下吸收度是不同的。因此，可以進行定性判別。

圖1 大鯢黏液粉的平均近紅外光譜 圖2 5種純樣品的平均近紅外光譜

2.2 摻偽大鯢黏液粉的平均近紅外光譜

圖3是摻入不同比例的4種物質(zhì)后形成的近紅外光譜圖。由圖可見，樣品與樣品間近紅外光譜的譜峰重疊非常嚴重，并且含有大量的噪聲信號，無法直接獲得光譜中有效的信息。Mabood F等[13]采用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量法很好地解決了摻假駱駝奶的鑒別研究，因此，建立光譜與化學(xué)參考值之間相關(guān)聯(lián)的化學(xué)計量學(xué)模型來處理數(shù)據(jù)是必不可少的。

圖3 4類摻偽大鯢黏液粉的平均近紅外光譜

2.3 定性分析結(jié)果

近紅外光譜在采集過程中會產(chǎn)生基線漂移、散射、噪音等問題，嚴重影響建模的精確度，采用適當?shù)墓庾V預(yù)處理方法會有效提高模型的精確度[14]。經(jīng)不同的預(yù)處理方法處理后產(chǎn)生的效果不同，有的可消除基線漂移和背景影響，有的可消除噪音，有的可消除由于顆粒大小不均產(chǎn)生的散射影響。并且不同的方法可疊加使用，疊加的效果也是有好有壞[15]。本文采用1SGD、2SGD、MSC、SNV、1SGD+MSC和1SGD+SNV共6種光譜預(yù)處理方法對原始光譜進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 PLS-DA法建立2分類摻偽大鯢黏液粉模型的判別結(jié)果

表2結(jié)果表明，采用6種預(yù)處理方法建立模型，其預(yù)測效果不同，且預(yù)處理模型的準確率均高于原始光譜的準確率。其中經(jīng)2SGD方法預(yù)處理后校正集和預(yù)測集的準確率最低，分別為99.17%和98.33%；經(jīng)1SGD+SNV方法光譜預(yù)處理后，模型校正集和預(yù)測集的準確率均為100%，該模型可以準確區(qū)分純樣品和摻偽樣品。

表3是5分類摻偽大鯢黏液粉模型判別情況。結(jié)果表明，1SGD+SNV光譜預(yù)處理的效果最優(yōu)，校正集和測試集的準確率高達100%。其他預(yù)處理方法均有誤判數(shù)，但準確率也在原始光譜之上。該模型可以區(qū)分純大鯢黏液粉和摻入土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉、大鯢皮粉的摻偽樣品。

表3 PLS-DA法建立5分類摻偽大鯢黏液粉模型的判別結(jié)果

續(xù)表

因此，確定一階導(dǎo)數(shù)+標準正太變量變換為大鯢黏液粉摻偽定性判別模型的較佳預(yù)處理方法。這是因為一階導(dǎo)數(shù)可以消除基線漂移和背景干擾，SNV能夠消除固體顆粒大小、表面散射和光程變化對光譜的影響[16]。索少增等[17]比較了消除常數(shù)偏移量、減去一條直線、矢量歸一化、最小最大歸一化等10種預(yù)處理方法對PLS建模效果的影響，得到SNV預(yù)處理后綜合參數(shù)最好。徐文杰等[18]為了建立最優(yōu)的淡水魚魚種鑒別模型，選擇了20余種不同光譜預(yù)處理對3種建模方法進行優(yōu)化。結(jié)果表明，其最佳的光譜預(yù)處理方法為數(shù)據(jù)標準化。所以，光譜預(yù)處理方法的選擇是因檢測對象的不同而存在差異的。

2.4 定量分析結(jié)果

圖4 主因子數(shù)與RMSECV的相關(guān)圖

主因子數(shù)目的大小影響建模效果的好壞。主因子數(shù)目過多，建模時會將無用的噪音當作有用信息來用，此時模型過擬合；主因子數(shù)目過少的話，會出現(xiàn)欠擬合，是因為光譜中的有用信息未能完全反饋[19]。本文采取交互驗證的方法確定合適的主因子數(shù)目。交互驗證均方根(RMSECV)的值可以反映模型預(yù)測的精準性，RMSECV值越小，說明模型的預(yù)測能力越強；RMSECV值最小時，此時的主因子數(shù)目最合適[20]。用優(yōu)化后的主因子數(shù)建立摻入土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉的摻偽樣品定量校正模型，用預(yù)測集對模型效果進行驗證。

圖4是校正集建模時前15個主因子數(shù)與所對應(yīng)的RMSECV值的相關(guān)關(guān)系圖。從圖中可知，當RMSECV值最小時，摻入土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉的摻偽大鯢黏液粉模型合適的主因子數(shù)分別為10、13、11和10。確定了合適的主因子數(shù)后對4個摻假樣品建立定量分析模型。

大鯢黏液分別摻入土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉和大鯢皮粉后定量模型測出的實際值與預(yù)測值的相互關(guān)系如圖5。由圖可知，這4類摻偽大鯢黏液粉定量校正模型的線性方程：y=1.003 4x+0.294 9，y=0.987x+1.153 5，y=1.023 5x-1.071 5，y=0.984 7x+1.385 6；相關(guān)系數(shù)(Rc2)分別為0.992 0、0.969 1、0.976 8和0.982 2，校正均方根誤差(RMSEC)分別為0.015 9、0.031 1、0.028 0和0.024 6。用預(yù)測集對校正模型進行檢驗，得到預(yù)測線性方程：y=1.011 7x-0.795 9，y=0.996 3x+0.895 5，y=0.977 7x+1.870 8，y=0.987 6x+1.122 7；相關(guān)系數(shù)(Rp2)分別為0.990 6、0.961 7、0.973 8和0.979 9，預(yù)測均方根誤差(RMSEP)分別為0.019 5、0.035 3、0.030 2和0.022 7。

圖5 4類摻偽大鯢黏液粉的實際值與預(yù)測值關(guān)系圖

4類摻偽大鯢黏液粉模型的Rc2和Rp2都達到了0.9以上，RMSEC和RMSEP趨近于0，說明所建的定量模型均呈線性相關(guān)，且具有較高的預(yù)測精確度和穩(wěn)定性。周曉璇等[21]也通過近紅外光譜結(jié)合PLSR法建立的摻低檔米定量模型和摻礦物油米定量模型均能很好實現(xiàn)對兩種摻偽大米的定量分析。因此，本研究采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘線性回歸法可以量化摻偽大鯢黏液粉的水平。

3 結(jié) 論

運用近紅外光譜結(jié)合PLS-DA建立了摻偽大鯢黏液粉的定性分析方法。PLS-DA判別模型中，比較了大鯢黏液粉及其摻偽物的原始光譜以及經(jīng)1SGD、2SGD、MSC、SNV、1SGD+MSC和1SGD+SNV等光譜預(yù)處理后所建模型判別效果。確定1SGD+SNV為較佳光譜預(yù)處理方法，所建2分類和5分類模型校正集與預(yù)測集的準確率均為100%。

運用近紅外光譜結(jié)合PLSR建立了摻偽大鯢黏液粉的定量分析方法。大鯢黏液粉分別摻土豆淀粉、大鯢肉粉、大鯢蛋白粉、大鯢皮粉模型預(yù)測精度高、相關(guān)性好，能實現(xiàn)對摻偽大鯢黏液粉的定量分析。