楊偉平，郭雷鋒，赫 倩

（洛陽師范學院生命科學學院，河南洛陽 471934）

農(nóng)作物秸稈作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，是我國重要的生物資源[1]。2016年我國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達81 565.30萬t[2]，但因含有大量木質素導致很難被充分利用。目前，秸稈雖然作為燃料、飼料和肥料和造紙工業(yè)的原料被利用，但當前農(nóng)作物秸稈焚燒量依然占27%[2]。

纖維素分解菌具有降解纖維素的能力，在提高秸稈利用效率方面具有一定的市場前景。王加友等[1]利用從土壤中分離到的1株纖維分解菌SY-403對玉米秸稈處理40 d時，秸稈的纖維素分解率達55.26%。美合熱阿依·木臺力甫[3]將2株乳酸菌與2株纖維素分解菌等比例混合后作為添加劑進行青貯發(fā)酵，發(fā)酵飼料的品質明顯提高，動物對干物質和中性洗滌纖維的消化率也顯著增高。黃旺洲[4]將分離到的纖維素分解菌群用于豬糞和牛糞的堆肥，發(fā)現(xiàn)纖維素分解菌群不僅能脫水、控制發(fā)酵過程的pH、使糞便中粗纖維和有機質被有力分解和降解，也可抑制糞便中NH3及H2S的釋放。

鵝是草食性動物，不僅具有發(fā)達的盲腸，其腸道內也存在著大量微生物，在利用粗纖維方面具有較大優(yōu)勢[5]。本試驗以鵝的新鮮糞便為材料，分離篩選高效降解纖維素的細菌并研究其特性，為動物微生態(tài)制劑、生物堆肥和除臭劑研究提供菌種資源和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 本試驗中所用鵝的新鮮糞便采集于洛陽師范學院伊濱校區(qū)月明湖畔。采集糞便時，除去其表面的雜草和泥土，取中間部分，裝封口塑料袋中，排氣封口，編號，放入干凈的泡沫盒中在短時間內帶回實驗室并進行纖維素細菌的分離。用于除臭試驗的雞糞便采集于洛陽市伊濱區(qū)某養(yǎng)雞場。

致病性大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為洛陽師范學院生命科學學院動物營養(yǎng)與健康調控研究室所保存。

1.2 培養(yǎng)基配制 纖維素分解菌的分離篩選培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基的配制見文獻[6]。

1.3 儀器 主要設備為萊卡正置熒光顯微鏡、BIOTEK Synergy H1型酶標儀、臺式高速冷凍離心機、Eppendorf PCR擴增儀、恒溫培養(yǎng)箱、凝膠成像分析儀、立式高壓蒸氣滅菌鍋等。

1.4 纖維素分解菌的初篩[6]稱取1.0 g鵝的新鮮糞便，轉移至一滅菌的三角瓶中，加入無菌水至100 mL刻度處，在80℃恒溫水浴鍋中振蕩30 min，即為糞便內容物10-2的稀釋液，將此液繼續(xù)進行梯度稀釋，然后涂板、培養(yǎng)、剛果紅染色[7]，最后挑取菌落周圍透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值大的菌落，接種至無菌的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在LB+1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）的平板上劃線分離純化培養(yǎng)2～3代，將純化后的菌種轉至斜面LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 纖維素分解菌的復篩 將初篩純化后的纖維素分解菌的菌液濃度調至OD600為0.5左右，按1%接種量接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h，5 000 r/min、4℃條件下離心發(fā)酵液15 min，其上清液即為粗酶液，最終以測得的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性高低作為復篩纖維素分解菌的標準。

CMCase活力的測定參照《飼料添加劑 纖維素酶活力的測定》（NY/T 912-2004），即分光光度法測定飼料添加劑中纖維素酶活力。其中，CMCase的酶活力單位用U/mL表示，定義：CMCase與底物CMC-Na在pH 5.5、40℃條件下反應30 min，每分鐘由底物CMCNa降解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

1.6 纖維素分解菌的鑒定方法

1.6.1 形態(tài)學鑒定 采用革蘭氏染色法，觀察分離到的纖維素分解菌在顯微鏡下的形態(tài)和染色特征，染色方法參照錢存柔等[8]的方法進行。

1.6.2 纖維素分解菌的16S rRNA基因鑒定 CTAB/NaCl法提取細菌基因組DNA[9]，然后以細菌基因組DNA為模板，使用細菌通用引物27F/1492R進行細菌16S rRNA基因擴增。PCR反應體系（25 μL）：DNA模板 1 μL（50～100 ng/μL），上、下游引（10 pmol /μL）物各 1 μL，2×PCR Master Mix 酶 12.5 μL，無離子水補足至25 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，50 s；30個循環(huán)；72℃延伸5 min。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因。將檢測正確的PCR產(chǎn)物送至北京中科希林生物科技有限責任公司進行測序。測序結果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中16S rRNA基因序列進行同源性分析。用Mega5.1中的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 纖維素分解菌的特性研究

1.7.1 耐熱性[6]將培養(yǎng)至24 h的纖維素分解菌（OD600=0.5）分別置于55、65、75、85℃水浴中處理30 min后用流水迅速冷卻，以未經(jīng)過熱處理的菌液作為對照，采用平板計數(shù)法，根據(jù)其存活率評價纖維素分解菌的耐熱能力。

1.7.2 抑菌特性 將試驗用的纖維素分解菌液（OD600=0.5）以1%接種量接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃160 r/min震蕩培養(yǎng)30 h后，12 000 r/min離心2 min，上清液備用。抑菌試驗采用牛津杯法[6]。

1.7.3 除臭特性 稱200 g新鮮的雞糞便置于干凈的塑料瓶中，以5%的接種量向瓶中添加濃度為1.0×108CFU/mL的纖維素分解菌、攪拌均勻，作為試驗組，每組做3個平行。試驗前排出發(fā)酵瓶中多余氣體，將集氣管一端連接裝糞便的瓶子（集氣管連接處密閉），另一端連接一定體積的集氣袋收集氣體，然后置于37℃的水浴鍋中發(fā)酵10 h并收集氣體。對照組以無菌水代替纖維素分解菌。試驗中NH3和H2S產(chǎn)量的測定分別采用納氏分光光度法《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第2部分：化學污染物》（GBT-18204.2-2014）和《天然氣中硫化氫含量的測定 碘量法 GB/T 11060.1-1998》進行，并計算該纖維素菌對雞糞便所產(chǎn)NH3和H2S的去除率。

1.8 統(tǒng)計分析 采用Excel整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件中Dancan′s法進行多重比較。

2 結 果

2.1 纖維素分解菌的篩選 采用剛果紅染色法初篩，發(fā)現(xiàn)在來自鵝糞便中的多株菌的菌落周圍都產(chǎn)生了清晰的透明圈。進一步將初篩到的菌株反復劃線純化培養(yǎng)、剛果紅染色，比較不同菌株菌落的形態(tài)大小、D/d值以及CMCase活性，最終確定將編號為G-6、D/d值為4.8（透明圈直徑為2.4 cm、菌落直徑為0.5 cm）以及CMCase為0.37 U/mL的纖維素分解菌用于后續(xù)試驗（圖1）。

圖1 試驗菌株G-6在CMC-Na板上的水解圈

2.2 菌株G-6的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 通過反復分離純化培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌株G-6為乳白色，大小均一、表面有褶皺，周邊呈鋸齒狀結構（圖2A）。革蘭氏染色陽性、桿狀，且有芽孢（圖2B）。

圖2 菌株G-6的形態(tài)特征和革蘭氏染色結果

圖4 菌株G-6 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 16S rRNA 基因鑒定 以試驗菌株G-6基因組DNA為模板，進行16S rRNA基因的PCR擴增，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到1 500 bp的目的條帶，其大小與預期結果基本一致（圖3）。將測序結果在NCBI里用BLAST程序對試驗菌株的16S rRNA基因序列進行比對，通過Mega6.0構建的系統(tǒng)進化樹進行同源性分析發(fā)現(xiàn)（圖4），該試驗菌株為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，命名為 Bacillus methylotrophic strain G-6。

2.3 Bacillus methylotrophic strain G-6的特性

2.3.1 耐熱性 通過耐熱試驗發(fā)現(xiàn)（表1），隨著溫度的升高，Bacillus methylotrophic strain G-6的存活率呈下降趨勢，但仍表現(xiàn)出較強的耐熱性。其中Bacillus methylotrophic strain G-6在55℃和65℃時的存活率顯著高于75℃和 85℃（P＜0.05）。

圖3 菌株G-6 的16S rRNA基因瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 Bacillus methylotrophic strain G-6的耐熱性（n=3）

2.3.2 抑菌特性 通過抑菌試驗（圖5）可知，Bacillus methylotrophic strain G-6對2種致病菌均表現(xiàn)出了一定的抑菌作用。其中，該試驗菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為13.63、16.17 mm。顯著性分析表明，該菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 除臭能力 由表2可知，對照組糞便中H2S和NH3的產(chǎn)量分別為18.64、79.3 g/m3，而試驗組則分別為7.86 、56.14 g/m3，極顯著低于對照組（P＜0.01）。進一步分析表明，Bacillus methylotrophic strain G-6對雞糞便H2S、NH3的去除率分別達57.8%、29.26%。

圖5 Bacillus methylotrophic strain G-6的抑菌圖

表2 Bacillus methylotrophic strain G-6對H2S和NH3的去除效果（n=3）

3 討 論

3.1 纖維素分解菌的分離 普通固體培養(yǎng)基中添加CMC-Na、結合剛果紅染色法分離篩選纖維素分解菌，因簡單快捷、成本低等優(yōu)點被廣泛采用[10]。但CMC-Na平板篩選法因不能定量反映纖維素分解菌產(chǎn)CMCase的真實能力，需用菌株進行液體發(fā)酵，根據(jù)其產(chǎn)纖維素酶活的高低進行復篩[11]。本試驗篩選出了1株具有高效降解纖維素的菌株G-6，最終被鑒定為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，命名為Bacillus methylotrophicus G-6。以LB+1%CMC為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，Bacillus methylotrophicus G-6纖維素酶活性高達0.37 U/mL，低于張盼等[12]從土壤中以及關怡等[13]從森林公園下的濕潤木屑中分離到的纖維素分解菌，高于王彥偉等[14]從竹蟲幼蟲的腸道中分離到的纖維素分解菌的產(chǎn)酶能力。諸多研究發(fā)現(xiàn)，纖維素分解菌CMCase活性大小不僅與菌種及來源、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵培養(yǎng)時間、測定采用的標準方法等因素有關[12-15]，還與纖維素酶的酶反應條件（如底物和發(fā)酵酶液的濃度、溫度、時間、種子液濃度、接種量等因素）有關[15]。

3.2 Bacillus methylotrophicus G-6的特性 目前，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）主要用于作物病害防治[16]、生物表面活性劑[17]等方面的研究。此外，譚澤文等[18]研究發(fā)現(xiàn)從土壤中分離到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對餐廚垃圾具有防蠅產(chǎn)蛆效果。但該菌用在生物堆肥及除臭的研究上還很少。徐杰等[19]將分離到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌L1和枯草芽孢桿菌X9、解淀粉芽孢桿菌L8組成復合菌劑后用于牛糞的堆肥，結果顯示復合菌劑不僅對木質纖維素有一定降解能力，而且具有使堆肥快速升溫和有效除臭的潛力。

本研究中，發(fā)現(xiàn)Bacillus methylotrophicus G-6菌株能耐受一定高溫，在55℃條件下其存活率達到90%以上，并且其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定抑制作用。此外，研究表明，NH3的揮發(fā)主要在堆肥前期（即升溫和高溫期）[20]，而H2S氣體的釋放量在不同動物糞便堆肥中釋放的早晚不同[21]。本試驗中，雞糞便在處理過程中NH3和H2S的產(chǎn)生與任順榮等[22]的研究結果基本一致，即初期H2S產(chǎn)量少，而NH3產(chǎn)量大。Bacillus methylotrophicus G-6對雞糞中H2S和NH3的去除率分別達57.81%和29.26%，低于張宏才等[23]從雞糞便中分離到的紅平紅球菌對NH3和H2S的去除率，但高于許啟有等[24]從豬糞便中分離到的短狀桿菌屬細菌X-3d等對NH3和H2S的去除率。由此可見，除臭菌的除臭效果不僅與其菌種及來源有很大關系，還與發(fā)酵初始pH、培養(yǎng)溫度及菌種接種量等有一定關系[23]。

4 結 論

本研究分離的纖維素分解菌為芽孢桿菌屬的甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌，它不僅能夠分泌纖維素酶，而且具有耐高溫、抑菌、去除NH3和H2S的特性。因此，纖維素分解菌在微生物制劑、生物堆肥或者動物糞便除臭劑的研究中具有一定潛力，后期將針對它的特性進行更深入研究。