滿淑麗，王 瑩，馬 江，王 媛，馬 龍

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

2型糖尿病是由多種病因引起的胰島素分泌缺陷或/和胰島素作用障礙所導(dǎo)致的糖、蛋白質(zhì)、水、脂肪和電解質(zhì)等代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要標(biāo)志．目前臨床上常用的口服降血糖藥主要包括胰島素分泌促進(jìn)藥物(磺酰脲類、瑞格列奈)、α-糖苷酶抑制劑、胰島素增敏藥(雙胍類)等．荔枝核為無(wú)患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn.)的干燥成熟種子，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛作用，能夠用于治療寒疝腹痛、睪丸腫痛，性甘、微苦、溫，歸肝、腎經(jīng)[1].《本草綱目》記載：“荔枝核治癲疝氣痛，婦人血?dú)獯掏础保欣笾?litchi semen，LSE)的復(fù)方合劑對(duì)降低糖尿病小鼠血糖、血脂的效果與臨床降糖藥二甲雙胍效果相似[2]，二甲雙胍可以通過(guò)激活肌肉等組織中的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[3]，抑制因脂肪酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素抵抗(IR)[4]．荔枝核提取物可以通過(guò)改善糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激、炎癥損傷[5]、脂代謝等以減輕對(duì)大鼠器官的損傷程度[6]．前期實(shí)驗(yàn)[6]發(fā)現(xiàn)其與糖代謝、脂代謝相關(guān)，而 AMPK是調(diào)控糖代謝、脂代謝通路的直接蛋白．因此，猜測(cè)荔枝核提取物對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)對(duì)組織器官中 AMPK的含量進(jìn)行調(diào)節(jié)．本文構(gòu)建了胰島素抵抗細(xì)胞模型，深入探討荔枝核提取物對(duì) IR細(xì)胞 AMPK的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)量的影響．

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

干燥的荔枝種子(核)于2014年12月購(gòu)自云南，經(jīng)天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院王春霞老師鑒定為藥典正品．人肝癌細(xì)胞 HepG2由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供．

甲醇、二甲基亞砜和乙腈，分析純，天津市康科德科技有限公司；蘆丁根皮苷，四川省維克奇生物科技有限公司；薯蕷皂苷，上海研拓生物科技有限公司；磷酸鉀、二甲基亞砜(DMSO)，天津市化學(xué)試劑二廠．

9700型 PCR擴(kuò)增儀，美國(guó) Applied Biosystems公司；Agilent 7980A型氣相色譜儀、Agilent 5975C型質(zhì)譜檢測(cè)器，安捷倫公司；凝膠成像儀，美國(guó)Pharmacia Biotech公司；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；D-101型大孔樹(shù)脂，河北翔泰藍(lán)星精細(xì)化工有限公司．

1.2 荔枝核有效成分提取方法及含量測(cè)定

稱取荔枝核 1kg洗凈，烘干破碎，依次用 95%、60%、30%乙醇和去離子水煮 2h，每種溶劑重復(fù)兩次，收集所有液體混合，濃縮．使用大孔樹(shù)脂柱[4,6]富集荔枝核不同極性層，依次用去離子水和體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%的乙醇為洗脫液依次洗脫．對(duì)洗脫液分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，烘干后獲得 3種提取層記為L(zhǎng)SE30、LSE50、LSE70，準(zhǔn)確稱量并記錄．

總多酚含量的測(cè)定：以 0.1g/mL沒(méi)食子酸的水溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．分別取 10mg LSE30、LSE50、LSE70，加蒸餾水定容至 10mL．取1mL置于10mL容量瓶中，加入6mL蒸餾水，溶解均勻后，再加入 0.5mL福林試劑，1min后加入 10%碳酸鈉溶液1.5mL，混勻定容．75℃水浴加熱10min，在 765nm 處測(cè)定吸光度，進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn)．利用回歸方程計(jì)算供試液中多酚的含量[4]．

總黃酮含量的測(cè)定：以 0.6g/mL蘆丁甲醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，在 510nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．配制0.5mg/mL LSE甲醇溶液，取1.0mL置于試管中，依次加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1mL、十水硝酸鋁溶液 0.5mL，每種試劑加完后靜置 5min，混勻后補(bǔ)加4%的氫氧化鈉溶液5mL，加蒸餾水至12.5mL，混勻，15min后測(cè)量其吸光度，進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn).利用回歸方程計(jì)算供試液中黃酮的含量[7]．

總皂苷含量的測(cè)定：用甲醇配制 0.4g/mL薯蕷皂苷[7]為標(biāo)準(zhǔn)品，在 535nm 處(全波段掃描 535nm處有最大吸收峰)測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．取10mg LSE加蒸餾水溶解，定容至10mL，取50μL水浴揮干，加入 4%香草醛冰醋酸溶液 40μL、高氯酸160μL，混勻后塞緊試管塞．在 55℃烘箱中反應(yīng)15min，冰水浴 3min，加入 1mL冰醋酸搖勻，測(cè)定吸光度，進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn)．利用回歸方程計(jì)算供試液中皂苷的含量．

總多糖含量的測(cè)定：在 620nm 處測(cè)定吸收峰，以 100μg/mL葡萄糖水溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．準(zhǔn)確稱量 10mg LSE，加水定容至 10mL．取1mL置于試管中，將試管置于冰水中，加入 4mL蒽酮-硫酸試液，冷卻后在沸水中煮沸 7min，重復(fù)之前冷卻操作，降至室溫，測(cè)定吸光度，進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn)．計(jì)算總多糖含量[8]．

原花青素含量的測(cè)定：以 1mg/mL甲醇原花青素B溶液為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．1mg/mL樣品溶液 20μL、4%香蘭素溶液 120μL、濃鹽酸 60μL混合，30℃暗處反應(yīng) 20min．在 500nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn)．利用回歸方程計(jì)算供試液中原花青素的含量[9]．

1.3 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立

胰島素最佳濃度的確定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化[7]，將含 2%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基置于 96孔板，細(xì)胞密度約為 106L-1．設(shè)置空白組(不包含細(xì)胞)、模型組，培養(yǎng) 24h．待細(xì)胞單層貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基，模型組的胰島素終濃度分別為 10、1、10-1、10-2、10-3μmol/L，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 36h．更換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育 24h，檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中剩余葡萄糖含量．

胰島素最佳作用時(shí)間的確定：設(shè)置空白組和模型組，模型組加入新鮮配制的胰島素最佳濃度的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 24、36、48h，更換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育24h，測(cè)定葡萄糖含量．

1.4 荔枝核提取物對(duì)胰島素耐受細(xì)胞的作用

分別設(shè)空白組(無(wú)細(xì)胞)、對(duì)照組(正常細(xì)胞)、模型對(duì)照組(胰島素抵抗細(xì)胞，不加藥)和模型加藥組(胰島素抵抗細(xì)胞，加藥 2.5、5.0mg/mL)．藥物作用1d后，分別檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖含量，計(jì)算各組細(xì)胞的耗糖量．

1.5 MTT法檢測(cè)胰島素抵抗模型的細(xì)胞凋亡

按照上述方法獲得具有胰島素抗性的HepG2細(xì)胞，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，接種于 96孔板內(nèi)，分組，分別加入 LSE30、LSE50、LSE70；作用 24h后棄去藥液，加入 0.5mg/mL MTT，置于培養(yǎng)箱中 4h后棄去上清液；加入 100μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 570nm 下測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率．

1.6 Real-time PCR基因表達(dá)分析

稱取糖尿病模型大鼠肝組織 50.0mg，在液氮作用下碾碎，迅速加入1mL Trizol充分研磨，向EP管中依次加入提取的 mRNA 1～5μg、Oligo(dT)12-18 2μL，2.5mmol/L dNTP 混合物(pH 中性)8μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至 15μL；70℃加熱 5min，冰上冷卻2min；依次加入 5×First-Strand緩沖液 4μL和TIANScript M-MLV 1μL(200U)，混勻．再向 200μL的離心管中加入 Template(＜1μg)、Primer1(10μmol/L) 1μL、Primer2(10μmol/L)1μL、10×Tap Buffer 5μL、DNTP Mixture(2.5μmol/L) 4μL、DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL ，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至50μL，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)．GAPDH 上游引物為 5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物為 5′-CTCACCTCCTCCAAGTTATT-3′；AMPKα2 上游引物為 5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′，下游引物為 5′-TCAGATGGGCTTATACAGC-3′．

1.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)蛋白表達(dá)分析

100mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)用 RAPI裂解液稀釋 100倍．稱取 100mg肝組織冰上研磨，加入10倍體積的含有PMSF和RAPI的裂解液，將液體轉(zhuǎn)入 EP管在冰上裂解 30min，12000r/min離心15min．取上清液，加入 3倍體積的 4×SDS上樣緩沖液，100℃水浴 5min，冷卻至室溫．進(jìn)行 SDSPAGE電泳實(shí)驗(yàn)，電流為 150mA，時(shí)間 40min．將轉(zhuǎn)好的 PVDF膜放入封閉液中，室溫封閉 1h．然后將一抗按說(shuō)明書(shū)稀釋，把膜放入一抗中室溫下孵育2h，TBST洗 5次，每次 5min．將二抗按說(shuō)明書(shū)稀釋，把 PVDF膜放入二抗中，室溫下孵育 1h，TBST洗3次，每次10min；用PBS洗1次，紅外Odessy掃描儀掃描．

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用 IBM SPSS statistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，*表示組間具有顯著差異(P＜0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝核提取物定量分析結(jié)果

按照 1.2節(jié)分別獲得 LSE30、LSE50和 LSE70的質(zhì)量分別為 10.30、99.08、74.58g．通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法分別測(cè)得 LSE30、LSE50、LSE70中的總多酚、總黃酮、總皂苷、總多糖和原花青素的含量見(jiàn)表 1．LSE50中總多酚、總黃酮、總皂苷和原花青素的提取產(chǎn)率最高，而總多糖的提取產(chǎn)率隨乙醇濃度的增加而下降．

表1 荔枝核提取物各成分總含量Tab. 1 Total content of each component in LSE

2.2 胰島素抵抗模型的建立

體外胰島素抵抗作用的間接反映就是細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率降低．對(duì)比圖 1(a)各組葡萄糖濃度，胰島素濃度為1μmol/L時(shí)，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度最高，細(xì)胞對(duì)胰島素的抵抗作用最強(qiáng)，因此選擇此胰島素濃度為細(xì)胞建模的最佳濃度．

圖1 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立Fig. 1 Insulin resistance model established with HepG2 cell

由圖 1(b)可知，作用 24h細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率最高，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率逐漸降低，因此選擇24h為細(xì)胞建模的最佳時(shí)間．綜上所述，濃度為 1μmol/L胰島素對(duì) HepG2細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞即為胰島素抵抗模型細(xì)胞．

2.3 MTT法測(cè)定成模細(xì)胞的活力

采用 MTT法測(cè)定荔枝核的提取物對(duì) HepG2細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)表 2．隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸降低；在相同濃度下，LSE50和LSE70的細(xì)胞存活率基本相同且低于 LSE30．為準(zhǔn)確量化 3種樣品對(duì)細(xì)胞殺傷能力的大小，應(yīng)用 SPSS 20.0軟件計(jì)算存活率達(dá)到 50%的時(shí)候的 IC50值.LSE30、LSE50和 LSE70的 IC50值分別為 24.60、11.70、12.02μg/mL．IC50值越小，則證明該樣品對(duì)HepeG2細(xì)胞殺傷能力越強(qiáng)．LSE50和 LSE70對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷能力近似相等且遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于LSE30．這可能與其黃酮、多酚類物質(zhì)的含量較高有關(guān)系．

表2 各實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞存活率(n＝4)Tab. 2 HepG2 cell survival in every experimental group(n＝4)

2.4 荔枝核提取物對(duì)體外胰島素抵抗細(xì)胞模型的作用

荔枝核提取物對(duì)胰島素抵抗模型細(xì)胞的作用如圖 2所示，*表示與模型組相比有顯著差異(P＜0.05)．5.0、2.5 μg/mL的 LSE70和 LSE50都有降糖活性，組間不存在顯著差異，但與模型組相比存在顯著差異(P＜0.05)；隨著藥物濃度的升高，降糖效果會(huì)逐漸增強(qiáng)，但藥效增強(qiáng)的同時(shí)，會(huì)造成對(duì)細(xì)胞的損傷．以上實(shí)驗(yàn)證明，LSE50和 LSE70活性均很好，由表 1可知組成也相當(dāng)，所以下面以 LSE70實(shí)驗(yàn)組為例，開(kāi)展下述實(shí)驗(yàn)．

圖2 荔枝核提取物對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型攝取葡萄糖的促進(jìn)作用Fig. 2 Effect of LSE on glucose uptake of HepG2 cells with insulin resistance

2.5 荔枝核提取物對(duì) AMPK基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響

以生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子AMPK為出發(fā)點(diǎn)，從細(xì)胞能量代謝的角度分析降糖機(jī)制．由于AMPK 的α 亞基起催化作用，α 2亞單元在肝臟、骨骼肌和心肌中表達(dá)較高，本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為肝細(xì)胞，所以在AMPK三聚體中選擇α 2亞單元進(jìn)行基因和蛋白水平的分析．用 Real-time PCR法和 Western blot法檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖3和圖4所示．由圖3和圖4可知：LSE組可逆轉(zhuǎn)因高濃度胰島素誘導(dǎo)而導(dǎo)致的 AMPKα 2基因水平下降以及逆轉(zhuǎn)因高濃度胰島素誘導(dǎo)而導(dǎo)致的 p-AMPK蛋白水平的下降．

圖3 荔枝核提取物對(duì) HepG2細(xì)胞中 AMPK基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig. 3 Effect of LSE on AMPK gene transcription in HepG2 cells

圖4 荔枝核提取物對(duì) HepG2細(xì)胞中 AMPK蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of LSE on AMPK protein expression in HepG2 cells

3 討 論

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，病死率僅次于腫瘤和心血管疾病，且其在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家均以指數(shù)形式增加，年輕化趨勢(shì)明顯．荔枝核中富含有黃酮[8]、多酚、皂苷和多糖類化合物．荔枝核對(duì)血清中升高的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性具有抑制作用，并能提高肝組織血清超氧化物歧化酶(SOD)的活力[10]，使肝細(xì)胞免受損傷，從而達(dá)到治療肝損傷目的[11]．荔枝核提取物有調(diào)節(jié)血糖、改善糖尿病糖脂代謝紊亂和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的作用[6]．2型糖尿病是由肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加、利用葡萄糖異常及胰島素分泌不足引起的，以胰島素抵抗和胰腺 β細(xì)胞功能失常為特征的疾病.AMPK是一種保守的異源三聚體，其酶活力能夠被腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)上調(diào)．該蛋白質(zhì)激酶能夠通過(guò)感受細(xì)胞能量狀態(tài)來(lái)維持真核細(xì)胞的三磷酸腺苷(ATP)生成和消耗的平衡，即形成能量穩(wěn)態(tài)．AMPK是機(jī)體保持葡萄糖平衡所必需的．由于分子機(jī)制十分復(fù)雜，藥物分子激活 AMP是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，但其激活能改善由 2型糖尿病引起的代謝失衡．同時(shí)，AMPK 在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、建立和穩(wěn)定細(xì)胞極性、調(diào)節(jié)動(dòng)物壽命、調(diào)控生理節(jié)律等方面也起著重要作用．目前有報(bào)道[6]稱荔枝核提取物可以顯著調(diào)節(jié)餐后血清中的脂類和膽固醇的含量，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其與糖、脂等代謝通路相關(guān)，而AMPK是其調(diào)控通路的直接蛋白，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一思路．Qi等[12]通過(guò)用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)荔枝核中不同極性層的有效成分進(jìn)行提取比較后，對(duì)使用荔枝核提取物灌胃治療的糖尿病大鼠的肝臟組織的 AMPKα 2和 p-AMPK的表達(dá)量進(jìn)行了比較及分析．文獻(xiàn)[5]報(bào)道用乙酸乙酯萃取的方法并不能對(duì)荔枝核中的原花青素起到富集的作用，但是可以起到富集荔枝核提取物中多酚和類黃酮類成分的作用．LSE50和 LSE70的化學(xué)成分和生物活性都極其相似，工業(yè)生產(chǎn)中可以將LSE50和LSE70兩層合并提取．AMPK通路的激活能改善由 2型糖尿病引起的代謝失衡．本研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核提取物可以阻止因高濃度胰島素誘導(dǎo)而導(dǎo)致的 AMPKα 2水平降低，調(diào)節(jié)和改善能量代謝．因此可以推測(cè)，荔枝核提取物對(duì)糖尿病模型大鼠的降糖作用可能與 AMPK的表達(dá)變化有關(guān)，相關(guān)的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究．