史丹陽(yáng)，劉美玲，劉 翔，張 建，張同存，王 楠

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

動(dòng)脈粥樣硬化等許多心血管系統(tǒng)疾病作為危害人類健康的危重疾病一直受到廣泛關(guān)注．成熟血管壁的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在血管損傷后由收縮表型向去分化表型的轉(zhuǎn)化在動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管疾病發(fā)生過程中有重要作用[1]．研究表明血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)與其順式作用元件 CarG[CC(A/T)6GG]-box的相互作用是啟動(dòng)血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)的核心機(jī)制[2]．myocardin是 2001年發(fā)現(xiàn)的核蛋白(stress associated protein，SAP)結(jié)構(gòu)域家族的一個(gè)成員，可在多種非肌細(xì)胞中與 SRF結(jié)合形成三聚體，并進(jìn)一步顯著激活CArG box依賴的平滑肌和心肌特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子，包括α 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle-actin，α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-myosin heavy chain，SM-MHC)、肌動(dòng)蛋白α 2(actin alpha 2，ACTA2)基因等[3]．從而在分子水平上影響著血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化．

微小 RNA(microRNAs，miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和遷徙等過程中具有重要作用，是調(diào)控諸多病理生理現(xiàn)象的關(guān)鍵小分子[4]．Gareri等[5]研究表明，miRNA在血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化中起到重要作用，miR-125a-5p通過靶向ETS-1(erythroblast transformation specific-1，ETS-1)調(diào)控血管平滑肌的表型轉(zhuǎn)化．但在 VSMCs表型轉(zhuǎn)化過程中myocardin與哪些miRNA相關(guān)目前尚未完全闡明．通過對(duì) miRNA的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn) miR-93-5p的啟動(dòng)子上有myocardin/SRF的結(jié)合位點(diǎn) CArG box，因此推測(cè)myocardin可能是調(diào)控 miR-93-5p的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子．本研究旨在通過功能獲得或缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞分化過程中 myocardin對(duì)miR-93-5p的轉(zhuǎn)錄激活作用．

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌種與質(zhì)粒

人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human aortic vascular smooth muscle cells，HA-VSMCs)由本實(shí)驗(yàn)室保藏，ATCC?編號(hào)為 CRL-1999．大腸桿菌(E.coli)DH5α、pGL3-Basic、pcDNA3.1-myocardin表達(dá)質(zhì)粒、pRIGFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質(zhì)粒、pRIGFP/Neo-Control(RNAi-control)質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 主要試劑

myocardin一抗(rabbit)，天津賽爾生物技術(shù)有限公司；ACTA2一抗(rabbit)、SM22一抗(rabbit)，Abcam公司；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗，Santa Cruz公司；山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗，Li-cor公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol 試劑，北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；NheⅠ限制性內(nèi)切酶、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶，Promega公司；SYBR Green q PCR Mastermix，DBI Bioscience公司；dNTPs、D2000 DNA ladder、DM 2000plus DNA marker、通用型柱式基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Kit)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒，Promega公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑，Roche公司．

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HA-VSMCs用含有10%胎牛血清(無噬菌體，低內(nèi)毒素)和 1% 100×青鏈霉素雙抗溶液的 DMEMHG培養(yǎng)基于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)．用 0.25%胰蛋白酶消化傳代，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 70%時(shí)，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)染空載對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)、myocardin過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-myocardin)、pRIGFP/Neo-Control(RNAi-control)質(zhì)粒和 pRI-GFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質(zhì)粒．所用質(zhì)粒濃度為 4μg/mL，操作按 X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行．在轉(zhuǎn)染后 48h收集不同條件處理的 HA-VSMCs，分別收集細(xì)胞總蛋白或總RNA，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

1.4 免疫印跡(Western blot)分析

收集各組細(xì)胞，SDS蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量．100℃變性 10min后，進(jìn)行 12% SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移將蛋白膠轉(zhuǎn)移至NC膜上．用5% 脫脂奶粉室溫封閉 1h后，分別用 ACTA2抗體(1∶500)、SM22α 抗體(1∶1000)、myocardin 抗體(1∶1000)在孵育袋中孵育，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗膜 3次，每次10min．隨后加入相對(duì)應(yīng)的二抗(山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗)室溫避光孵育 2h，PBS洗膜 3次，每次 10min．Oddysey遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)掃膜，用Image J軟件對(duì) Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析．

1.5 總 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)

先用 Trizol法提取總 RNA，參照 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄．每組取 2μg總 RNA分別用miR-93-5p的反轉(zhuǎn)錄引物作為特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA．miR-93-5p 的反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGACTGGATACGACCTACCTG-3′．取 2μL產(chǎn)物進(jìn)行 Real-time PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20μL：master mix 10μL，無菌蒸餾水 7.6μL，上、下游引物各 0.5μL，cDNA 模板 1μL，50× ROX 0.4μL．PCR 條件：95℃預(yù)變性 2min；95℃變性10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s；40 個(gè)循環(huán)；95℃10s終止反應(yīng)．檢測(cè)miR-93-5p的表達(dá)水平(U6為內(nèi)參)，U6 上游引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物 為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-93-5p上游引物為5′-GAGTGTCAAAGTGCTGT TCGTG-3′，下游引物為 5′-GCAGGGTCCGAGGTAT TC-3′．

1.6 人基因組的提取

按通用型柱式基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Kit)提取基因組，先將人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞用胰酶消化處理為細(xì)胞懸液離心后棄上清液，加 200μL GTL，震蕩樣品至懸??；加入 20μL Proteinase K、200μL Buffer GL，震蕩混勻，56℃水浴10min，離心后加入 200μL無水乙醇并混勻．按照基因組試劑盒說明書將上述步驟中所得溶液加入收集管的吸附柱中，離心棄廢液，向吸附柱中依次加入500μL Buffer GW1、500μL Buffer GW2，離心后棄廢液并將吸附柱徹底晾干．最后向吸附柱的中間部位懸空加入50～200μL Buffer GE或滅菌水，室溫放置2～5min，離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存.

1.7 miR-93-5p的啟動(dòng)子質(zhì)粒構(gòu)建和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

在NCBI上查找miR-93-5p的啟動(dòng)子序列，根據(jù)文獻(xiàn)查出與myocardin結(jié)合的CArG(CCTTAAAGG)結(jié)合位點(diǎn)．根據(jù)其序列以及pGL3載體確定酶切位點(diǎn)為 NheⅠ和 XhoⅠ，運(yùn)用 Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物為 5′-GTAGCTAGCCAGGTGAATTTCATGTTT AGACTGGAGT-3′(NheⅠ)，下游引物為 5′-ATTCTC GAGCCAAGACGGGAGGACAGAAAGGAA-3′(XhoⅠ)，片段為 1028bp．PCR 反應(yīng)條件：94℃熱啟動(dòng)5min；94℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸 10min，4℃保存．以人基因組為模板，按上述 PCR條件擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物．用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物與用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的pGL3-Basic質(zhì)粒用 T4 DNA 連接酶于 16℃孵育器連接 24h．轉(zhuǎn)化DH5α，在氨芐霉素抗性平板上挑選單克隆后，在氨芐霉素抗性液體 LB培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng) 14h后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序．

隨后在 24孔板中進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)．過表達(dá)myocardin實(shí)驗(yàn)組為啟動(dòng)子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pcDNA3.1-myocardin 表達(dá)質(zhì)粒 0.5μg，對(duì)照組為啟動(dòng)子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒 0.5μg；干擾 myocardin實(shí)驗(yàn)組為 啟 動(dòng) 子 (pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pRIGFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)干擾質(zhì)粒 0.5μg，對(duì)照組為啟動(dòng)子(pGL3-Basic-p-miR-93-5p)0.5μg、pRI-GFP/Neo-Control(RNAi-control)對(duì)照質(zhì)粒0.5μg；2μL脂質(zhì)體．實(shí)驗(yàn)步驟參考熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染 24h后加入 Luc裂解物冰上裂解細(xì)胞 30min，吸取 50μL裂解物，加入至預(yù)冷的白色 96孔板中；在酶標(biāo)儀上設(shè)置程序．隨后采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定．

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SASV8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)．

2 結(jié)果與分析

2.1 myocardin過表達(dá)促進(jìn)HA-VSMCs分化

為證實(shí) myocardin在平滑肌細(xì)胞分化過程中的重要作用，將對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)和 myocardin表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-myocardin)分別轉(zhuǎn)染入 HAVSMCs中 48h，利用 Western blot方法檢測(cè)myocardin的表達(dá)情況．已有研究證實(shí) ACTA2和SM22α 是收縮型 VSMCs的最具特點(diǎn)的標(biāo)志基因，通常以二者的表達(dá)活性作為判定 VSMCs分化表型的依據(jù)，因此檢測(cè)了分化標(biāo)志性基因 ACTA2和SM22α 的蛋白水平，結(jié)果如圖1所示．

圖1 myocardin促進(jìn)HA-VSMCs特異性基因的表達(dá)Fig. 1 Expression of HA-VSMC specific genes upregulated by myocardin

與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-myocardin質(zhì)粒組 myocardin蛋白水平顯著上調(diào)，同時(shí)分化標(biāo)志基因ACTA2和 SM22α 的蛋白水平也顯著升高．這說明myocardin能顯著上調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌標(biāo)志基因的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化．

2.2 干擾myocardin抑制HA-VSMCs分化

為進(jìn)一步證實(shí) myocardin對(duì)平滑肌細(xì)胞分化的影響，將對(duì)照質(zhì)粒(RNAi-control)和 myocardin干擾質(zhì)粒(RNAi-myocardin)分別轉(zhuǎn)染入 HA-VSMCs中48h，利用 Western blot方法檢測(cè) myocardin和分化標(biāo)志性基因 ACTA2和 SM22α 的蛋白水平，結(jié)果如圖2所示．

圖2 myocardin抑制HA-VSMCs特異性基因的表達(dá)Fig. 2 Expression of HA-VSMC specific genes downregulated by myocardin

與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 RNAi-myocardin質(zhì)粒組myocardin蛋白水平顯著下調(diào)，同時(shí)分化標(biāo)志基因ACTA2和 SM22α 的蛋白水平也分別下調(diào) 40%和35%左右．這說明干擾 myocardin能顯著下調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌標(biāo)志基因的表達(dá)，抑制血管平滑肌細(xì)胞分化.

2.3 myocardin與miR-93-5p的表達(dá)水平成正相關(guān)

對(duì) miRNA的啟動(dòng)子分析中發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p啟動(dòng)子上含有 myocardin的結(jié)合位點(diǎn) CArG box，因此myocardin可能是上調(diào) miR-93-5p的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子．為證實(shí)這一結(jié)論，在 HA-VSMCs中過表達(dá)myocardin．提取 RNA，逆轉(zhuǎn)后 Real-time PCR 檢測(cè)miR-93-5p的表達(dá)量，以U6為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖3所示，過表達(dá)myocardin后，miR-93-5p的表達(dá)顯著上調(diào)．這說明在平滑肌分化過程中 myocardin上調(diào)了miR-93-5p的水平．

圖3 過表達(dá)myocardin上調(diào)miR-93-5p水平Fig. 3 Myocardin upregulating the expression of miR-93-5p

2.4 干擾myocardin影響miR-93-5p的表達(dá)

進(jìn)一步在HA-VSMCs中轉(zhuǎn)染myocardin的干擾質(zhì)粒 pRI-GFP/Neo-Myocd(RNAi-myocardin)降低內(nèi)源性myocardin的表達(dá)水平后，檢測(cè)miR-93-5p的表達(dá)水平．提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)miR-93-5p的表達(dá)量，以 U6為內(nèi)參基因，miR-93-5p的水平也顯著下降(圖 4)．這些結(jié)果進(jìn)一步說明miR-93-5p與 myocardin的表達(dá)成正相關(guān)，并且有可能介導(dǎo)myocardin對(duì)VSMCs特異性分化過程的調(diào)控.

圖4 干擾myocardin表達(dá)下調(diào)miR-93-5p水平Fig. 4 Myocardin downregulating the expression of miR-93-5p

2.5 miR-93-5p的啟動(dòng)子質(zhì)粒構(gòu)建

為證實(shí)myocardin能否激活miR-93-5p的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建 miR-93-5p啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒．在NCBI上查找 miR-93-5p的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物，從人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中獲得人的基因組序列作為模板，通過PCR法獲得所需要的啟動(dòng)子序列1028bp(從-1037bp到0bp)，結(jié)果如圖5(a)所示．將pGL3-Basic載體和純化后的PCR片段分別用NheⅠ和XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切，獲得目的片段和空載的線性片段．隨后將兩條線性片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化．當(dāng)平皿上長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落，小提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖 5(b)所示．pGL3-p-miR-93-5p-luc質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后產(chǎn)生兩個(gè)片段，大小分別為4818bp和1028bp，4818bp片段與載體大小一致，1028bp片段與 PCR產(chǎn)物大小一致．這初步證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，進(jìn)一步通過測(cè)序鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建成功．

圖5 構(gòu)建miR-93-5p啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒Fig. 5 Luciferase reporting the construction of plasmid containing promoter miR-93-5p

2.6 myocardin增強(qiáng)miR-93-5p的啟動(dòng)子活性

利用成功構(gòu)建的 miR-93-5p啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告分析．在HA-VSMCs中共同轉(zhuǎn)染 myocardin質(zhì)粒和 miR-93-5p啟動(dòng)子質(zhì)粒，以 myocardin的空載質(zhì)粒 pcDNA3.1和 miR-93-5p啟動(dòng)子質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)為對(duì)照，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)分析，結(jié)果如圖 6所示．myocardin能夠顯著增強(qiáng)miR-93-5p啟動(dòng)子活性(圖 6(a))，而敲低 myocardin的表達(dá)后，miR-93-5p的活性也顯著降低(圖6(b))．這表明 myocardin能增強(qiáng) miR-93-5p的啟動(dòng)子活性，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄．

圖6 myocardin增強(qiáng)miR-93-5p的啟動(dòng)子活性Fig. 6 Myocardin enhancing the promoter activity of miR-93-5p

3 討 論

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一組非蛋白編碼小分子，廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動(dòng)物體內(nèi)．成熟后能夠通過核酸序列互補(bǔ)識(shí)別特定的目標(biāo)，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的．研究表明：其參與了細(xì)胞分裂增殖、分化與發(fā)育以及代謝等許多重要的生物學(xué)過程，因此有可能成為疾病診斷、預(yù)后判斷的指標(biāo)及治療靶點(diǎn)．此外，在不同效應(yīng)細(xì)胞亞群的分化中起重要作用．已有報(bào)道在 VSMCs中 miRNA在細(xì)胞多種功能中都起到了十分重要的作用[6]．目前已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了 miR-125a-5p、miR-145[7]、miR-23b[8]、miR-18a-5p[9]等都能夠直接或者間接影響 VSMCs的表型轉(zhuǎn)化．Li等[10]證實(shí)myocardin可以通過上調(diào)miR-206促進(jìn)平滑肌向分化表型轉(zhuǎn)化．但對(duì)于平滑肌分化過程中受到 myocardin調(diào)控的miRNA的了解仍然有限．

本研究發(fā)現(xiàn) myocardin可以通過上調(diào)平滑肌分化標(biāo)志基因 SM22α 和 ACTA2的表達(dá)，促進(jìn)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向分化表型轉(zhuǎn)化，在此過程中 miR-93-5p的水平上調(diào)．而 myocardin的功能缺失實(shí)驗(yàn)證實(shí)在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中敲低 myocardin的表達(dá)可以顯著降低miR-93-5p的水平．這些結(jié)果證實(shí)在平滑肌分化過程中myocardin與miR-93-5p的相關(guān)性．目前對(duì)于miR-93-5p的功能知之甚少，已有報(bào)道大多集中于腫瘤細(xì)胞中．miR-93-5p在腫瘤細(xì)胞中的作用也不盡相同，已經(jīng)證實(shí) miR-93-5p促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移[11]、子宮內(nèi)膜癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[12]，但卻抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[13]．目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān) miR-93-5p在血管平滑肌細(xì)胞中功能的相關(guān)報(bào)道，而本研究則證實(shí)了 miR-93-5p可能參與 myocardin調(diào)控的血管平滑肌細(xì)胞分化過程，myocardin可以激活miR-93-5p的啟動(dòng)子活性，進(jìn)而促進(jìn)miR-93-5p的轉(zhuǎn)錄．

綜上所述，myocardin很可能通過上調(diào) miR-93-5p參與對(duì) VSMCs分化的調(diào)節(jié)．本研究所得結(jié)果為發(fā)現(xiàn) myocardin功能的新機(jī)制提供初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并且發(fā)現(xiàn) miR-93-5p可能參與血管平滑肌分化表型的調(diào)控作用．這對(duì)于心血管疾病病理機(jī)制的研究及新臨床治療靶標(biāo)的研發(fā)提供參考．