邊小禹 梁宗鎖，2 常朝陽(yáng)* 馬存德 孫建華

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712100；2浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310000；3陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西咸陽(yáng)712000；4陜西漢王略陽(yáng)中藥科技有限公司，陜西略陽(yáng)724300）

豬苓（Polyporus umbellatus）為非褶菌目多孔菌科樹(shù)花屬藥用真菌，其地下部分——菌核，即中藥豬苓，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材，具有利水滲濕之功效[1]。真菌菌核是在特殊環(huán)境下由營(yíng)養(yǎng)菌絲交織聚集而成的具有抵御惡劣環(huán)境能力的休眠結(jié)構(gòu)[2]。豬苓菌核按其表皮顏色可分為三個(gè)時(shí)期，依次為“白苓”“灰苓”和“黑苓”。每年春天來(lái)臨，地溫升高至10℃時(shí)，菌核開(kāi)始萌發(fā)，至五月左右長(zhǎng)成白苓。入秋后溫度降低，白苓表皮顏色逐漸加深，越冬后形成灰苓，再經(jīng)過(guò)一個(gè)冬天灰苓轉(zhuǎn)化成黑苓[3]。從“白苓”到“灰苓”，豬苓的共生真菌——蜜環(huán)菌的侵染由無(wú)到有；從“灰苓”到“黑苓”階段，侵染程度逐漸增強(qiáng)，“黑苓”菌絲木質(zhì)化并產(chǎn)生中空的隔離腔[4]。并且，豬苓有效成分——多糖和麥角甾醇的積累隨著豬苓發(fā)育的成熟不斷增加[5]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，黑色素合成與真菌的微菌核形成[6]、抗逆性和致病性[7-8]均有緊密的聯(lián)系。而對(duì)于地下生長(zhǎng)的豬苓菌核，黑色素的積累與菌絲的固化對(duì)于水分過(guò)多滲入、蜜環(huán)菌侵染和蟲(chóng)害的防御是否起到關(guān)鍵作用，還需進(jìn)一步研究。目前已報(bào)道了許多病原真菌菌核的黑色素研究，而大型藥用真菌的黑色素研究較少，豬苓菌核表皮黑色素的研究未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)對(duì)成熟階段豬苓菌核（黑苓）表皮色素的鑒定，以期能進(jìn)一步了解豬苓生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的代謝規(guī)律，為分子水平研究豬苓菌核發(fā)育過(guò)程中黑色素的關(guān)鍵作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

豬苓成熟菌核（黑苓）表皮：豬苓菌核切取表皮并烘干。豬苓菌核由陜西省漢中市略陽(yáng)縣陜西漢王藥業(yè)豬苓GAP種植基地提供。

儀器為DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DC-100型高速多功能粉碎機(jī)，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；AUW120型電子天平，SHIMADZU；XMTD-8222型恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ-250B型超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；3900H型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立公司；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

黑色素標(biāo)準(zhǔn)品（melanin synthetic cell culture tested）屬于多巴黑色素，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，試驗(yàn)用水為純水，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬苓菌核表皮黑色素的提取與純化

參照姚增玉（2007）文獻(xiàn)中的方法并略有改動(dòng)[9]。稱(chēng)取50 g豬苓菌核表皮，加水煮沸15 min以除去水溶性雜質(zhì)及材料中的氣體；經(jīng)NaOH溶液提取HCl溶液沉淀得到黑色素的粗提物；經(jīng)酸水解、有機(jī)溶劑抽提、反復(fù)沉淀、去除Cl-并干燥的純化工藝得到黑色素的顆粒狀固體，真空干燥至恒重，得率為（0.147±0.103）%，置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 黑色素溶液的配制

干燥的黑色素樣品按2∶1（mg/mL）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的氨水超聲輔助溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至pH 7.5，用蒸餾水稀釋至所需濃度[9]。

1.2.3 黑色素的溶解性與化學(xué)定性分析

在水、氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氨水溶液中分別加入豬苓菌核表皮黑色素的精提物，觀察黑色素的溶解情況；在高錳酸鉀溶液、重鉻酸鉀溶液、次氯酸鈉、過(guò)氧化氫（雙氧水）、氯化鐵溶液、鐵氰化鉀和氯化鐵混合液、氯化鈉-明膠溶液中各加入黑色素的水溶液，觀察溶液顏色；在濾紙上滴加黑色素的乙醇溶液，待揮發(fā)干后，滴加三氯化鋁乙醇溶液，烘干后在紫外燈下觀察是否有熒光[9-10]。

1.2.4 黑色素紫外-可見(jiàn)光譜特征的測(cè)定

以蒸餾水為空白對(duì)照，黑色素的水溶液于200～800 nm進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光光譜掃描。

1.2.5 黑色素紅外光譜特征的測(cè)定

采用溴化鉀壓片法。將溴化鉀結(jié)晶塊在玻璃研缽中研成細(xì)粉，作為背景扣除，樣品與溴化鉀按1∶100混合研磨成細(xì)粉，進(jìn)行壓片并檢測(cè)。

1.2.6 黑色素的穩(wěn)定性測(cè)定

黑色素濃度均以25μg/mL作為其穩(wěn)定性的試驗(yàn)濃度。

1.2.6.1 溫度對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

設(shè)25℃、75℃和100℃三個(gè)梯度，分別在0.5 h、1.0 h、0.5 h、2.0 h和4.5 h對(duì)樣品進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.6.2 pH對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

以磷酸和磷酸二氫鈉溶液配制pH2的緩沖液，以檸檬酸和磷酸氫二鈉溶液配制pH3、pH4和pH5的緩沖液，以磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液配制pH6、pH7和pH8的緩沖溶液，以碳酸鈉和碳酸氫鈉溶液配制pH9.16和pH10.83的緩沖液，將高濃度黑色素水溶液以上述緩沖液稀釋至25μg/mL，13 000 g離心30 min，于紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描。

1.2.6.3 冷凍對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

將pH4、pH5、pH6、pH7、pH8 和pH9.16的黑色素水溶液，分為兩組，分別于4℃和-20℃下放置2 h，13 000 g離心30 min，于紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描。

1.2.6.4 光照對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

設(shè)光照箱中和紫外燈下照射兩組，以避光處理為對(duì)照，分別于3 h、2 d和5 d時(shí)進(jìn)行紫外光譜的掃描。

1.2.7 黑色素抗氧化活性的測(cè)定

抗氧化活性的測(cè)定均以與黑色素水溶液相同濃度梯度的抗壞血酸（VC）和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7.1 清除羥自由基（·OH）活性的測(cè)定

配制50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL和150μg/mL的黑色素水溶液。羥自由基清除活性的測(cè)定參照（凌關(guān)庭，2004）的方法并略有改動(dòng)[11]。先后于試管中加入1 mL樣品、1 mL 1，10-菲咯啉、1.5 mL磷酸緩沖液、1 mL FeSO4和1 mL H2O2溶液，混合物于37℃下反應(yīng)30 min，于536 nm處檢測(cè)吸光值，記作As；以水代替樣品記作Ab；以水替代樣品和H2O2記作A0；以水調(diào)零。

Inhibition（%）=[（As-Ab）/（A0-Ab）]×100

1.2.7.2 清除超氧陰離子自由基（O2·-）活性的測(cè)定

配 制 100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL的黑色素水溶液，具體方法參照（Duan，2007）的方法并略有改動(dòng)[12]。先后于兩份試管中加入2 mL L-蛋氨酸、2 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)、1 mL乙二胺四乙酸二鈉、0.5 mL樣品、1 mL核黃素溶液，一份置于暗處，于560 nm處檢測(cè)吸光值，記作Aj；一份置于光照箱中，室溫反應(yīng)15 min后，立即遮光，記作A；以水代替樣品，一份置于暗處，用于調(diào)零，一份置于光照箱中，記作A′。

Inhibition（%）=[1-（A-Aj）/A']×100

1.2.7.3 還原力的測(cè)定

配 制 100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL的黑色素水溶液。參照（Oyaizu，1986）的方法測(cè)定并略有改動(dòng)[13]。先后于試管中加入樣品、磷酸緩沖液、鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混合物于50℃水浴中反應(yīng)20 min；取出后加入2.5 mL三氯乙酸，于650 g的離心力下離心10 min；取上清液5 mL，加入蒸餾水4 mL，三氯化鐵1 mL，于700 nm處檢測(cè)吸光值。

圖1 紫外-可見(jiàn)光譜圖（左）和吸光度對(duì)數(shù)的線性擬合（右）

1.2.7.4 總多酚含量的測(cè)定

配 制 100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL和500μg/mL的黑色素水溶液。采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定并略有改動(dòng)[14]。先后于試管中加入1 mL樣品、5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后于室溫下靜置8 min，加入4 mL碳酸鈉溶液，搖勻后室溫靜置2 h，3000 g離心10 min，于760 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并使用IBM SPSS Statistics 23、Origin Pro 2015和 GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解性與化學(xué)定性

豬苓菌核表皮黑色素具有典型的黑色素溶解特性，不溶于水，乙酸乙酯、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑，微溶于乙醇，在pH3時(shí)完全沉淀，溶于堿性溶液。化學(xué)定性試驗(yàn)結(jié)果：多酚反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明該色素含有酚羥基；與氯化鈉-明膠溶液反應(yīng)未有白色沉淀形成，表明該色素不能凝固蛋白，不是鞣質(zhì)；三氯化鋁反應(yīng)未有熒光現(xiàn)象，表明該色素不具有黃酮類(lèi)色素結(jié)構(gòu)；可以被氧化劑漂白，尤其對(duì)次氯酸鈉敏感，見(jiàn)表1。

表1 豬苓菌核表皮黑色素的溶解性與化學(xué)定性

2.2 紫外-可見(jiàn)光譜

如圖1，成熟豬苓菌核（黑苓）表皮黑色素在200～800 nm掃描紫外-可見(jiàn)光光譜，隨著波長(zhǎng)的增加，吸光度呈指數(shù)型逐漸下降[15-16]。與標(biāo)準(zhǔn)品一致，在270～280 nm有小的肩峰，是由于蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸的光吸收[17]。將吸光度對(duì)數(shù)對(duì)波長(zhǎng)作圖，得到斜率為-0.00245的直線，標(biāo)準(zhǔn)品黑色素的斜率為-0.00248，該斜率為不同來(lái)源黑色素的特征性參數(shù)，但放置一月的樣品所得斜率為-0.0036，這可能是黑色素氧化的緣故[16，18-19]。

2.3 紅外光譜

紅外光譜可以表征黑色素的主要功能性基團(tuán)，由于黑色素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以其紅外光譜是一系列寬而強(qiáng)的吸收峰，每個(gè)寬峰都是由多種官能團(tuán)振動(dòng)產(chǎn)生的。如圖2，豬苓菌核表皮黑色素吸收峰主要分布在3500～3300 cm-1、2970～2900 cm-1、1650～1600 cm-1、1400～1380 cm-1、1260～1200 cm-1幾組峰，分別是由于聚合體中—OH的伸縮振動(dòng)，脂肪族—CH的伸縮振動(dòng)，芳香環(huán)中C=C、C=N骨架彎曲和羧酸外C=O伸縮振動(dòng)，COO—的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，酚羥基和羧基中羥基的伸縮和彎曲振動(dòng)形成的，900～600 cm-1吸收峰較弱，是由于芳環(huán)被取代，形成共軛關(guān)系。以上具有典型的黑色素結(jié)構(gòu)特征。黑色素標(biāo)準(zhǔn)品具有NH的伸縮振動(dòng)，COOH中C=O的伸縮振動(dòng)，芳香環(huán)中C=C、C=N的彎曲和羧酸外C=O伸縮振動(dòng)，NH彎曲、CN伸縮振動(dòng)（酰胺II帶）和芳香環(huán)C=C拉伸，COO—的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，酚羥基和羧基中羥基的伸縮和彎曲振動(dòng)，羥基振動(dòng)。豬苓菌核表皮黑色素和標(biāo)準(zhǔn)品黑色素的官能團(tuán)組成大體一致，但特征峰位置和波形卻差異較大，缺少1590～1610 cm-1多巴黑色素的特征吸收峰，所以豬苓菌核表皮黑色素在結(jié)構(gòu)上異于多巴黑色素[20-21]。

2.4 穩(wěn)定性

（1）溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖2 豬苓菌核表皮黑色素和標(biāo)準(zhǔn)品黑色素的紅外光譜圖

圖3 溫度對(duì)豬苓菌核表皮黑色素的影響

圖5 冷凍對(duì)豬苓菌核表皮黑色素的影響

如圖3所示，高溫對(duì)黑色素具有增色效應(yīng)，1.5 h之后，增色效應(yīng)差異更為顯著，在1.5 h之前，黑色素的耐熱性良好。在1.0 h以后，75℃下黑色素的增色效應(yīng)開(kāi)始變化顯著；在1.5 h后，25℃下黑色素的增色效應(yīng)開(kāi)始變化顯著（P＜0.05）；在0.5～4.5 h，100℃下黑色素的吸光度積分始終顯著增高。

（2）pH對(duì)穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，當(dāng)pH≤3時(shí)，黑色素完全沉淀，隨著pH的升高，黑色素溶解于溶液中，并且增色效應(yīng)顯著增強(qiáng)，當(dāng)溶液成中性或弱堿性時(shí)，即pH7和pH8之間，增色效應(yīng)不顯著。

（3）冷凍對(duì)穩(wěn)定性的影響

圖4 pH對(duì)豬苓菌核表皮黑色素的影響

圖6 光照對(duì)豬苓菌核表皮黑色素的影響

如圖5所示，冷凍對(duì)黑色素的影響取決于pH，當(dāng)pH小于7時(shí)，即在酸性溶液中，冷凍對(duì)黑色素有減色效應(yīng)，當(dāng)pH≥7時(shí)，即黑色素處于中性和堿性溶液中時(shí)，冷凍對(duì)于黑色素的穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。

（4）光照對(duì)穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，光照對(duì)于黑色素有顯著的減色效應(yīng)，尤其隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黑色素的穩(wěn)定性越差，當(dāng)用紫外燈照射5 d時(shí)，黑色素在350～550 nm間的吸光度積分降到8.5左右。紫外光照對(duì)黑色素結(jié)構(gòu)的破壞程度最強(qiáng)，白熾燈其次，黑暗處理最弱，即黑色素穩(wěn)定性最高。

2.5 黑色素抗氧化活性

（1）清除羥自由基活性

圖7 豬苓菌核表皮黑色素對(duì)羥自由基的清除效果

如圖7所示，黑色素對(duì)羥自由基的清除率與質(zhì)量濃度具有量效關(guān)系，在50～100μg/mL，其羥自由基清除率顯著高于VC與BHT，在100～150μg/mL，BHT的清除率與濃度的正相關(guān)關(guān)系趨于穩(wěn)定，顯著高于黑色素和VC，而黑色素始終高于VC（P＜0.05），且增勢(shì)較高。

（2）清除超氧陰離子自由基活性

如圖8所示，在100～400μg/mL，豬苓菌核表皮黑色素與VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性無(wú)顯著差異（P＜0.05），但顯著高于BHT。在400～500μg/mL，黑色素清除自由基活性增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，而B(niǎo)HT在100～200μg/mL與400～500μg/mL，清除率增勢(shì)均不顯著。

（3）還原力活性

如圖9所示，VC的還原力顯著優(yōu)于黑色素與BHT，BHT較黑色素還原力稍強(qiáng)，在300～500μg/mL，黑色素的還原力增勢(shì)變緩。

圖8 豬苓菌核表皮黑色素對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果

圖9 豬苓菌核表皮黑色素的還原力

（4）總多酚含量

圖10 豬苓菌核表皮黑色素的總多酚含量

如圖10所示，三種物質(zhì)的總多酚含量與濃度成正相關(guān)，依次為VC＞BHT＞黑色素，1 g黑色素、VC和BHT的總多酚含量分別相當(dāng)于（224.48±11.46）mg、（504.05±79.67）mg和（309.20±73.63）mg沒(méi)食子酸。

3 小結(jié)與討論

研究首次從豬苓菌核表皮中提取純化出了黑色素，并從溶解性與化學(xué)定性，紫外光譜與紅外光譜，黑色素穩(wěn)定性及抗氧化活性等方面對(duì)其進(jìn)行了鑒定。

（1）豬苓菌核表皮黑色素具有典型的黑色素溶解特性：不溶于水和常見(jiàn)的有機(jī)溶劑；在pH3時(shí)完全沉淀，溶于堿性溶液。化學(xué)定性表明該色素含有酚羥基，不具有鞣質(zhì)和黃酮類(lèi)色素的特性，易被次氯酸鈉漂白。

（2）豬苓菌核表皮黑色素在紫外光區(qū)有很強(qiáng)的吸收，隨著波長(zhǎng)的增大，吸光度呈指數(shù)型降低，在可見(jiàn)光區(qū)內(nèi)吸光度極弱。吸光度的對(duì)數(shù)對(duì)波長(zhǎng)作圖，得到斜率為負(fù)的直線，不同來(lái)源的黑色素也具有斜率為負(fù)的對(duì)數(shù)吸光圖。豬苓菌核表皮的斜率為-0.00245，與其他來(lái)源的黑色素類(lèi)似，例如：齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）黑色素[22]和黑木耳（Auricularia auricula）黑色素[23]為-0.0028，山杏種皮（Testae of wild apricot）黑色素[9]和弗蘭克氏菌（Frankia sp.）黑色素[24]為-0.0039，放置一月后的樣品斜率為-0.0036，可能是氧化的緣故。紅外光譜分析表明，豬苓菌核表皮黑色素含有大量的—OH和—CH，較多的C=C、C=N、C=O、COO—等基團(tuán)，并且大量芳香環(huán)被取代，形成共軛體系。

（3）黑色素是由酚類(lèi)或吲哚類(lèi)聚合而成的生物大分子，而酚羥基易被氧化成醌基。高溫處理對(duì)黑色素略有增色效應(yīng)，耐熱性良好；當(dāng)pH≤3時(shí)，黑色素完全沉淀，當(dāng)pH處于4～10.83時(shí)，顏色隨著pH的提高逐漸加深；冷凍對(duì)于黑色素穩(wěn)定性的影響取決于溶液的pH，當(dāng)pH≤6時(shí)，即黑色素處于酸性溶液中，冷凍破壞了黑色素膠體或溶液的平衡狀態(tài)，使黑色素沉淀出來(lái)[9]，隨著pH的降低，-20℃處理比4℃處理的黑色素沉淀更多；豬苓菌核表皮黑色素對(duì)光照極為敏感，依次為紫外燈＞白熾燈＞避光處理，紫外燈照射5 d可使黑色素發(fā)生肉眼可見(jiàn)的褪色。有文獻(xiàn)表明，紫外線可誘導(dǎo)黑色素溶液中羥自由基的形成，從而促進(jìn)其氧化褪色[25]。

（4）黑色素能清除活性氧和自由基，是比SOD/POD更古老的抗氧化自由基保護(hù)系統(tǒng)。研究選擇四個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)判豬苓菌核表皮黑色素的抗氧化活性：豬苓菌核表皮黑色素清除羥自由基的活性顯著高于VC，在50～100μg/mL，顯著高于BHT；清除超氧陰離子自由基活性與VC差異不顯著，但顯著高于BHT；還原力與BHT無(wú)顯著差異，顯著低于VC；總多酚含量顯著低于VC和BHT，可能是由于提取過(guò)程中酚羥基過(guò)度氧化成醌基的原因。

黑色素在菌核等真菌結(jié)構(gòu)中起到提高抗張強(qiáng)度[26]和抑制真菌細(xì)胞壁溶解[27-28]的作用。在真菌病原體中，黑色素有助于穿透宿主[29]。研究首次鑒定了豬苓菌核表皮黑色素，為從分子水平上研究豬苓的藥理藥效及發(fā)育過(guò)程提供了新的思路和基礎(chǔ)。對(duì)于黑色素在豬苓菌核的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的機(jī)制，我們將進(jìn)行進(jìn)一步的研究。