張瑞益，李 強(qiáng)，相微微，劉 寰

（榆林學(xué)院，陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西榆林719000）

赤小豆（Vigna angrlaris），又名赤豆，豆科豇豆屬，為一年生草本植物的種子，一般呈赤色，形狀為橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，是亞洲地區(qū)主要的豆類作物之一。我國(guó)的赤小豆栽培面積、生產(chǎn)量和出口量均為世界第一[1]。赤小豆含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，其中，蛋白質(zhì)含量17.5%～23.3%，淀粉48.2%～60.1%，食物纖維5.6%～18.6%[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤小豆有抗氧化、降血脂、降血糖的作用[4-6]。中醫(yī)認(rèn)為，赤小豆性平，有解毒排膿、消腫利尿等功效[7-8]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種可清除超氧自由基的金屬酶類[9]。它是超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)的催化劑，使超氧陰離子轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫，從而保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子自由基的危害[10-12]，起到抗輻射、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)人體免疫等作用。SOD可在微生物、植物、動(dòng)物體內(nèi)提取到，此過(guò)程有太多的因素需要綜合考慮，如：提取效率、材料資本、提取工藝可操作性、生產(chǎn)周期長(zhǎng)短及最終產(chǎn)物活力等[13-14]，因此，并不是所有的原料都是SOD提取的理想對(duì)象。過(guò)去的SOD大多以血液為材料進(jìn)行提取，此過(guò)程不僅工藝復(fù)雜、不易保存、制備成本高，而且還會(huì)引發(fā)病毒交叉感染的潛在危險(xiǎn)[15]。相比之下，以植物為材料提取SOD有較高的安全性，為了高效提取SOD，近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者進(jìn)行了大量研究。超聲波輔助提取法通過(guò)破壞細(xì)胞組織來(lái)提取物質(zhì)，使得浸提效果強(qiáng)化，與其他方法相比，具有提取效率高、耗能低、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[16-18]。

本試驗(yàn)以京農(nóng)紅8號(hào)赤小豆為材料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化出赤小豆子葉SOD提取的最佳工藝條件，并應(yīng)用最佳工藝條件對(duì)8個(gè)不同品種的赤小豆子葉SOD進(jìn)行提取和分析，旨在研究赤小豆不同組織SOD的含量，同時(shí)也為赤小豆資源在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等方面更好、更充分的利用提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試赤小豆品種為京農(nóng)8號(hào)、吉紅2號(hào)、冀紅9218、遼小豆2號(hào)、中紅10號(hào)、小豐2號(hào)、白紅3號(hào)、龍小豆3號(hào)，均由榆林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。其中，京農(nóng)8號(hào)為本試驗(yàn)SOD提取技術(shù)優(yōu)化的對(duì)象。

核黃素（VB2）購(gòu)于上海試劑二廠；濃鹽酸、氫氧化鈉、L-甲硫氨酸（Met），均購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA），購(gòu)于西安化學(xué)試劑廠；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 赤小豆的培養(yǎng) 稱取200 g顆粒飽滿、大小均勻的京農(nóng)8號(hào)赤小豆種子，浸泡于蒸餾水中10 min，之后將其在培養(yǎng)皿中鋪勻，置于28℃恒溫箱中進(jìn)行觀察（此過(guò)程培養(yǎng)皿需保持一定水分，并及時(shí)清除霉變個(gè)體）。待芽體長(zhǎng)至15 cm左右，取子葉研磨，以備用。其余7種赤小豆培養(yǎng)方法相同。

1.2.2 赤小豆SOD提取流程 在赤小豆子葉研磨物中加0.05 mol/L磷酸緩沖液混勻，置于超聲波提取器，之后在水浴鍋中浸提，最后在4℃，1 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液定容至50 mL備用。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 在7個(gè)影響赤小豆子葉SOD活性的相關(guān)因素中，變化其中一種參數(shù)，固定其他參數(shù)，測(cè)定赤小豆子葉SOD的活力大小，得出一定的規(guī)律，來(lái)確定7個(gè)相關(guān)因素的最優(yōu)值。具體參數(shù)設(shè)置列于表1。

表1 單因素參數(shù)設(shè)計(jì)

1.2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，可知磷酸緩沖液pH值、液固比、超聲波功率、水浴浸提溫度這4個(gè)因素對(duì)赤小豆SOD提取結(jié)果影響較大。設(shè)計(jì)表2所示的4因素3水平試驗(yàn)，得到最優(yōu)的赤小豆子葉SOD的提取方法。

表2 正交試驗(yàn)（L9（34）因素水平

1.2.5 赤小豆子葉SOD提取率計(jì)算 首先進(jìn)行光照反應(yīng)，將裝有SOD提取液的試管置于熒光燈下20 min；其次測(cè)定吸光值，光度計(jì)為560 nm；最后根據(jù)所得吸光值計(jì)算SOD的活力，計(jì)算公式如下。

式中，W為樣品鮮質(zhì)量（0.5 g）；v為測(cè)定酶液用量（0.1 mL）；V 為提取液總量（20 mL）；u為 1個(gè)酶活單位。

1.2.6 不同品種赤小豆子葉SOD含量測(cè)定 用正交試驗(yàn)優(yōu)化出的各因素最佳值，提取8個(gè)品種的赤小豆子葉的SOD，并測(cè)出其活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)定數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)赤小豆子葉SOD提取率的影響

由圖1可知，超聲功率為140 W時(shí)，赤小豆子葉SOD活力值最大，為13.61 U/g；當(dāng)超聲功率為125，155 W時(shí)，二者間SOD活力沒(méi)有顯著差異，分別為 10.91，11.27 U/g；當(dāng)超聲功率為 110，170 W時(shí)，二者間SOD活力也沒(méi)有顯著差異，170 W時(shí)，SOD活力值最低，為6.47 U/g?？芍诔暪β蕿?40 W時(shí)，SOD的活力值最大，為赤小豆子葉SOD提取的最適宜超聲功率條件。

2.1.2 液固比對(duì)赤小豆子葉SOD提取率的影響

由圖2可知，在不同液固比條件下，SOD活力差異顯著。SOD活力隨著固液比的增大呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。在液固比為20∶1（mL/g）時(shí)，SOD的活力達(dá)到最大值，為赤小豆子葉SOD提取的最適宜液固比。

2.1.3 磷酸緩沖液pH值對(duì)赤小豆子葉SOD提取率的影響 由圖3可知，不同pH值條件下，SOD的活力存在顯著差異。隨磷酸緩沖液pH值的增大，SOD活力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。在pH值為7.0時(shí)，SOD的活力達(dá)到最大值，為赤小豆子葉SOD提取的最適宜pH條件。這是由于SOD的酶特性，其活性很容易受到pH值大小的影響。

2.1.4 水浴浸提溫度對(duì)赤小豆子葉SOD提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)水浴浸提溫度為50℃時(shí)，赤小豆子葉SOD活力最大，為12.82 U/g；當(dāng)水浴溫度為40，60℃時(shí)，二者間SOD活力沒(méi)有顯著差異，SOD活力分別為11.21，10.64U/g；當(dāng)水浴溫度為30，70℃時(shí)，二者間SOD活力也沒(méi)有顯著差異，70℃條件下，SOD活力最低，為6.54 U/g?？芍?，在水浴溫度為50℃時(shí)，SOD的活力達(dá)到最大值，為赤小豆子葉SOD提取的最適宜水浴溫度條件。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，可能會(huì)對(duì)SOD造成部分損害，而溫度過(guò)低時(shí)，SOD提取不夠充分。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)SOD提取率的影響 由圖5可知，不同的超聲時(shí)間條件下，SOD活力存在顯著差異。隨著超聲時(shí)間的增加，SOD活力呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間為25 min時(shí)，SOD活力達(dá)到最大，該時(shí)間長(zhǎng)度為赤小豆子葉SOD提取的最適宜超聲時(shí)間。超聲時(shí)間在一定范圍內(nèi)增大可以使SOD的提取更加充分，但是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而會(huì)影響SOD的活力。

2.1.6 水浴浸提時(shí)間對(duì)SOD提取率的影響 由圖6可知，不同的水浴浸提時(shí)間下SOD活力有顯著差異，當(dāng)水浴浸提時(shí)間為1.5 h時(shí)，SOD活力達(dá)到了最大值。水浴浸提時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響SOD的活性，時(shí)間太短會(huì)使SOD提取不夠充分。

2.1.7 超聲水浴溫度對(duì)SOD提取率的影響 由圖7可知，超聲水浴溫度在30～50℃時(shí)，SOD的活力隨溫度的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。在溫度為45℃時(shí)，SOD活力達(dá)到最大值，該值為赤小豆子葉SOD提取的最適宜溫度。當(dāng)溫度大于45℃時(shí)，SOD活力反而下降，可能是由于高溫對(duì)SOD酶性產(chǎn)生了影響，其中，SOD活力在超聲水浴溫度在30，50℃之間差異不顯著。

2.2 正交試驗(yàn)

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由單因素的試驗(yàn)結(jié)果可知，影響赤小豆子葉SOD提取率的4個(gè)主要因素為液固比、超聲功率、磷酸緩沖液pH值和水浴浸提溫度。在采用單因素試驗(yàn)所得的最佳超聲水浴溫度、最佳超聲時(shí)間及最佳水浴浸提時(shí)間的條件下，正交試驗(yàn)分析4因素3水平下赤小豆子葉SOD提取的最適宜工藝參數(shù)，具體結(jié)果列于表3。

由表3可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D1，即液固比為15∶1（mL/g）、超聲提取功率為140 W、磷酸緩沖液pH值為7.0和水浴浸提溫度40℃，是赤小豆子葉SOD提取的最佳工藝參數(shù)。以上各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響都較大，但超聲功率對(duì)赤小豆子葉SOD活力影響最大，4種因素的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D。

2.3 不同品種赤小豆子葉SOD的含量分析

對(duì)8種赤小豆子葉SOD用優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果列于表4。從表4可以看出，8種品種的SOD值均存在顯著差異；其中，SOD活性最高的為小豐7號(hào)，其活性為14.17 U/g，活性最低的是吉紅2號(hào)，其活性僅為8.97 U/g，8種品種赤小豆子葉SOD活性在8.97～14.17 U/g之間變動(dòng)，其SOD活性極差為5.20 U/g。

表4 不同品種赤小豆子葉SOD活力值 U/g

3 討論

本試驗(yàn)首先以京農(nóng)紅8號(hào)赤小豆子葉為SOD的提取材料進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)所得結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，來(lái)優(yōu)化影響赤小豆子葉SOD提取率的4種主要因素，最終得出最優(yōu)且可行的組合為超聲提取功率140 W、磷酸緩沖液pH值7.0、液固比15∶1（mL/g）、水浴浸提溫度40℃。4種因素影響從大到小的順序?yàn)槌暪β剩玖姿峋彌_液pH值＞液固比＞水浴溫度，超聲提取功率這一因素影響最大。

利用優(yōu)化試驗(yàn)得出的SOD最佳提取工藝對(duì)8種赤小豆子葉SOD進(jìn)行提取，并比較它們SOD的活力值，結(jié)果表明，8種赤小豆子葉SOD的活性有顯著差異，其值在8.97～14.17U/g，其中，小豐7號(hào)赤小豆子葉SOD活力最高，為14.17 U/g，而吉紅2號(hào)赤小豆子葉SOD活力最低，其活力值僅為8.97 U/g。造成這種差異的原因可能是由于培育不同品種赤小豆的土壤、氣候、人為灌溉、施肥等因素的不同所致，也可能是由于不同品種赤小豆自身生活的理化性質(zhì)導(dǎo)致。本試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上可以為今后更好的在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等方面利用赤小豆資源提供一定的理論依據(jù)。