王友玲 魏竹君 劉 青朱立磊 肖海芳 宋元達(dá)

(1. 山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2. 山東玉兔食品有限公司，山東 淄博 255300)

丁酸是一種重要的短鏈脂肪酸，由結(jié)腸益生菌發(fā)酵不易消化的糖類(lèi)產(chǎn)生。據(jù)大量的研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，丁酸具有多重生理功能，可為結(jié)腸細(xì)胞生長(zhǎng)供能，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)和抑制腸道炎癥、癌癥發(fā)生等。其抑制腫瘤的首要機(jī)制是作為一種去乙酰化酶(histone deacetylase)的抑制劑，主要通過(guò)改變組蛋白的乙?；潭葋?lái)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，參與多種基因的表達(dá)，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞成熟分化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[4]。

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是人體正常的腸道細(xì)菌，革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，其發(fā)酵產(chǎn)物以丁酸和乳酸為主，副產(chǎn)物還有乙酸、丁醇、淀粉酶、脂肪酶和維生素等[5]。由于是發(fā)酵產(chǎn)物，丁酸梭菌具有極強(qiáng)的整腸作用，可用于治療腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、腸易激綜合征等，其微生物制劑已在臨床得以廣泛應(yīng)用[6]。目前發(fā)現(xiàn)的丁酸梭菌主要是由多種來(lái)源分離純化而得到的野生型菌株，如牲畜糞便[7]、河畔污泥[8]、朗姆酒發(fā)酵液[9]等。

酪丁酸梭菌(Clostridiumtyroburicum)是一種典型的產(chǎn)丁酸微生物[10-11]，屬于有機(jī)化能異養(yǎng)型專(zhuān)性厭氧菌，革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌酪丁酸梭菌不能水解明膠、血清蛋白，可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖，并產(chǎn)生丁酸、乳酸、丙酸和乙酸等短鏈脂肪酸[12]。Luo等[13]研究了木糖、葡萄糖為碳源時(shí)丁酸的產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪丁酸梭菌更偏好葡萄糖為碳源。Jiang等[14]利用纖維床固定化酪丁酸梭菌發(fā)酵葡萄糖，丁酸得率達(dá)到0.46 g/L。

丁酸梭菌和酪丁酸梭菌作為產(chǎn)丁酸的代表性菌株，其各自的發(fā)酵特性和生物活性已被廣泛研究。劉磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌CBM01最佳碳源和最佳氮源分別是葡糖糖和蛋白胨；邢宏觀等[16]采用響應(yīng)面法對(duì)丁酸梭菌生物量的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后菌體數(shù)達(dá)到1.01×109個(gè)/mL；吳杰等[17]發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌對(duì)健康大鼠生長(zhǎng)沒(méi)有負(fù)面影響，對(duì)脂多糖導(dǎo)致的腸道蔗糖酶活性降低起到抑制作用；Liu[18]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了酪丁酸梭菌磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶缺失體，產(chǎn)酸量提高到0.4 g/g；Song等[19]以褐藻為碳源，采用分批發(fā)酵和半連續(xù)發(fā)酵，丁酸產(chǎn)率為0.252 g/g。由此看來(lái)對(duì)丁酸梭菌的研究大多集中于加大其生物量及其在動(dòng)物飼料上的運(yùn)用，而到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)丁酸梭菌和酪丁酸梭菌產(chǎn)丁酸量的比較研究。本研究擬以不同來(lái)源的丁酸梭菌和酪丁酸梭菌為出發(fā)菌株，比較它們?cè)谕缓铣膳囵B(yǎng)基中的發(fā)酵特性和產(chǎn)酸能力，旨在揭示不同屬產(chǎn)丁酸菌的差異，為后期研究產(chǎn)丁酸菌株在代謝途徑上的差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

ClostridiumbutyricumNK：分離于山東理工大學(xué)志愿者糞便；

ClostridiumbutyricumSY：分離于山東扳倒井股份有限公司酒窖窖泥；

ClostridiumbutyricumRX：分離于桓臺(tái)縣馬橋鎮(zhèn)匯源養(yǎng)牛場(chǎng)魯西黃牛腸道內(nèi)容物；

ClostridiumtyrobutyricumATCC25755：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

快捷型提取DNA試劑盒：山東賽恩斯科技有限公司；

葡萄糖：分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

丁酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

3.5-二硝基水楊酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

二氯甲烷：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

離心機(jī)：5038R型，德國(guó)Eppendorf公司；

電泳儀：DYY-6D型，北京市六一儀器廠；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2600型，日本島津公司；

氣相色譜儀：6980N型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

(1) 篩選培養(yǎng)基：葡萄糖8 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH(7.0±0.1)，121 ℃滅菌20 min。

(2) 種子培養(yǎng)基：酵母膏3 g，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，可溶性淀粉1 g，葡萄糖5 g，氯化鈉3 g，乙酸鈉3 g，瓊脂15 g，刃天青3 mg，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

(3) 合成發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，硫酸銨3 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀1 g，刃天青3 mg，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的分離純化 參考文獻(xiàn)[8]方法分離純化菌種，分別稱(chēng)取1 g糞便、窖泥和動(dòng)物腸道內(nèi)容物裝入9 mL無(wú)菌無(wú)氧的厭氧管中。充分振蕩后，在無(wú)氧條件下采用10倍梯度稀釋法制成為10-2，10-3，10-4，10-5稀釋液，分別取0.1 mL涂布在固體篩選培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)基長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行鏡檢，對(duì)符合梭狀芽孢桿菌特征的單菌落劃線、接種到新鮮固體篩選培養(yǎng)基上，37 ℃ 厭氧培養(yǎng)48 h，重復(fù)上述操作2次。獲取單菌落種子培養(yǎng)基懸液培養(yǎng)，分別進(jìn)行16S rDNA基因系列分析，直到獲得丁酸梭菌菌株。

1.2.3 16S rDNA基因系列分析 按照文獻(xiàn)[20]提取細(xì)菌基因組DNA，對(duì)獲得的總基因組DNA進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，采用通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTA-CGACTT-3，，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s；退火47 ℃ 2 min；35cycle；72 ℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增片段回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，繪制發(fā)育樹(shù)，確定菌株在系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上的歸屬菌株。

1.2.4 菌株生長(zhǎng)特性及發(fā)酵培養(yǎng) 將活化的篩選菌株NK，SY，RX及酪丁酸梭菌ATCC25755菌液按2%接種于液體種子培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，每2 h 取樣1次，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)菌液吸光度值(OD600)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

將活化的菌株NK，SY，RX及酪丁酸梭菌ATCC25755菌液按2%接種于液體種子培養(yǎng)基中，待其長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以3%的接種量接種于200 mL合成發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)。發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣測(cè)定菌體生物量、發(fā)酵液中還原糖含量、以及乳酸、丁酸的含量。

1.3 發(fā)酵特性指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生物量 采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處的吸光值。

1.3.2 pH值 采用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.3 還原糖 采用3，5-二硝基水楊酸法[21]。

1.3.4 丁酸和乳酸 采用氣相色譜分析[22]，發(fā)酵液經(jīng)離心后取上清液2 mL于提取瓶中，加入12.5%的硫酸—甲醇溶液1 mL，混勻，60 ℃水浴加熱6 h，自然冷卻至室溫，加入2 mL二氯甲烷，充分振蕩使其混勻，靜置分層后，取下層溶液轉(zhuǎn)移到新的提取瓶中，重復(fù)萃取3次。合并萃取液并加入飽和NaCl溶液1.5 mL洗滌，4 000 r/min離心5 min后，取下層溶液進(jìn)行氣相分析。氣相分析條件：FID檢測(cè)器，DB-FFAP毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃。升溫程序?yàn)?00 ℃保持1 min，再以3 ℃/min升溫至160 ℃，然后以10 ℃/min升溫至240 ℃，并保持5 min；進(jìn)樣量為1 μL，載氣為氮?dú)狻?/p>

分別配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述處理后作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值。采用Excel 2003對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 7.5 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA基因序列分析

2.1.1 菌株NK、SY、RX 16S rDNA基因片段PCR產(chǎn)物擴(kuò)增 16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA系列，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度保守性，而且大小在1.5 kb左右，容易利用PCR技術(shù)得到其序列。由圖1可以看出，菌株NK、SY、RX的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在1.5 kb左右，說(shuō)明是其16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 菌株NK 2. 菌株SY 3. 菌株RX

2.1.2 菌株NK、SY、RX 16S rDNA基因序列及進(jìn)化發(fā)育樹(shù) 經(jīng)測(cè)定，菌株NK、SY、RX的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度分別為1 415，1 416，1 412 bp。使用DNAstar分析3株菌株的A、G、T和C比例如圖2所示，其A+T所占比例分別為47.70%，47.74%，47.66%，因它們是同一屬種，所以相似度很高。酪丁酸梭菌ATCC25755菌種的A+T所占比例為47.46%，與以上菌株相比，有較大差異。

圖2 菌株NK、SY、RX、酪丁酸梭菌ATCC 25755

Figure 2 A, G, C and T ratio of 16S rDNA sequence in strain NK SY RX andClostridiumtyrobutyricumATCC25755

菌株NK、SY、RX 16S rDNA核苷酸序列在National Center Biotechnology Information 使用BLASTN程序進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示菌株NK、SY、RX 16S rDNA核苷酸序列分別和ClostridiumbutyricumW4，ClostridiumbutyricumB1，ClostridiumbutyricumDSM2477的核苷酸序列同源性為99%。用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3，菌株NK、SY、RX在Clostridium屬發(fā)育樹(shù)一個(gè)分支上，與Clostridiumbutyricum種的菌種在一個(gè)類(lèi)群內(nèi)而與其他種處于不同的分支上，所以把它們分別命名為ClostridiumbutyricumNK、ClostridiumbutyricumSY、ClostridiumbutyricumRX。

2.1.3 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌的生長(zhǎng)曲線 如圖4可見(jiàn)，各菌株在種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4～12 h，所以確定種子菌液接入發(fā)酵培養(yǎng)基的時(shí)間點(diǎn)為8 h，同理，丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755菌液接入時(shí)間點(diǎn)確定為12 h。

2.2 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基中的發(fā)酵特性比較

2.2.1 生物量的變化 隨發(fā)酵進(jìn)行，菌體生物量變化如圖5所示。丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY具有良好的生長(zhǎng)性能，生長(zhǎng)速率較丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755大，在0～16 h內(nèi)迅速達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，OD600分別為7.09和6.44。而丁酸梭菌RX和酪丁酸梭菌ATCC25755生長(zhǎng)速率較小，在16 h時(shí)僅分別為3.80和3.16，并且穩(wěn)定期菌體細(xì)胞濃度也比丁酸梭菌NK和丁酸梭菌SY低。

2.2.2 還原糖的變化 碳源作為微生物生長(zhǎng)不可或缺的能量來(lái)源之一，丁酸梭菌和酪丁酸梭菌所能夠利用的碳源以葡萄糖為最佳，所以在合成發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖為碳源。如圖6所示：發(fā)酵結(jié)束后，4株菌種均有葡萄糖剩余，其中丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX在32 h時(shí)葡萄糖殘留值相當(dāng)，分別為20.02，19.26，20.56 g/L，此后剩余葡萄糖變化不大，說(shuō)明發(fā)酵趨于停止。在相同的發(fā)酵條件下，酪丁酸梭菌比每一株丁酸梭菌產(chǎn)丁酸量都要多，所以酪丁酸梭菌ATCC25755較3株丁酸梭菌而言，剩余葡萄糖較少，為14.35 g/L。4株菌種均有葡萄糖殘留的原因是隨著發(fā)酵進(jìn)行酸的產(chǎn)生，導(dǎo)致pH 下降，pH下降到一定程度，進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞代謝能力減弱。這與Fu等[23]的研究結(jié)果趨勢(shì)是一致的。

圖3 菌株NK、SY、RX 基于16S rDNA基因發(fā)育樹(shù)Figure 3 16S rDNA gene-based phylogenetic tree of strain NK SY RX

圖4 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌的生長(zhǎng)曲線Figure 4 Growth curve of Clostridium butyricum andClostridium tyrobutyricum

圖5 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基發(fā)酵的生物量變化

Figure 5 Biomass changes in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

2.2.3 pH的變化 pH對(duì)微生物生長(zhǎng)具有顯著影響，一般細(xì)菌的生長(zhǎng)最適pH值為7左右，所以發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH設(shè)為7。接入種子培養(yǎng)液之后，丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY、丁酸梭菌RX 和酪丁酸梭菌ATCC25755的初始pH分別為6.30，6.17，6.25，6.23。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由于上述菌株均是以產(chǎn)丁酸為主的菌株，發(fā)酵液的pH呈逐漸降低趨勢(shì)。3株不同的丁酸梭菌雖然來(lái)源不同，但是對(duì)酸的耐受度卻相差不大，32 h細(xì)胞生物量基本上達(dá)到最大值，還原糖也不再消耗(圖7)，此時(shí)丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX的pH分別為4.22，4.29，4.24。與3株丁酸梭菌相比較，酪丁酸梭菌對(duì)酸的耐受力較強(qiáng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液的pH值為3.85。

圖6 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基發(fā)酵的還原糖變化

Figure 6 Changes of reducible carbohydrate in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

圖7 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基發(fā)酵的pH變化

Figure 7 Changes of pH in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

2.2.4 產(chǎn)酸量的變化 不同菌株對(duì)原料的利用率及產(chǎn)酸能力不同。菌株利用葡萄糖發(fā)酵的產(chǎn)酸量變化如圖8所示。由圖8可知，菌株丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY及丁酸梭菌RX的丁酸產(chǎn)量變化趨勢(shì)相同，前8 h丁酸產(chǎn)量緩慢增長(zhǎng)，8～24 h持續(xù)快速增長(zhǎng)。據(jù)孔青[24]研究，丁酸梭菌產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系為非生長(zhǎng)偶聯(lián)性，菌株在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期才開(kāi)始產(chǎn)生大量丁酸。到后期，丁酸梭菌菌株由于pH的脅迫和細(xì)胞衰亡等原因，產(chǎn)丁酸速率減緩。比較丁酸最后的積累量發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌RX產(chǎn)丁酸能力差異不大，分別為2.07，1.97 g/L，得率(丁酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗量)分別為0.23，0.21 g/g，丁酸梭菌SY稍低于二者，產(chǎn)丁酸量為1.66 g/L，得率為0.17 g/g。酪丁酸梭菌ATCC25755產(chǎn)丁酸能力很強(qiáng)，8～48 h時(shí)產(chǎn)丁酸量保持快速增長(zhǎng)，最終達(dá)到6.47 g/L，得率為0.41 g/g。Luo等[18]研究發(fā)現(xiàn)在初始葡萄糖濃度為75 g/L 時(shí)，酪丁酸梭菌ATCC25755發(fā)酵產(chǎn)丁酸得率為0.36 g/g。

除丁酸外，丁酸梭菌和酪丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)物還有乳酸[25]，由乳酸脫氫酶催化丙酮酸而得到。如圖9所示，丁酸梭菌NK、丁酸梭菌SY和丁酸梭菌RX發(fā)酵葡萄糖的乳酸產(chǎn)量變化趨勢(shì)相同，前8 h快速增長(zhǎng)，32 h后基本達(dá)到穩(wěn)定，產(chǎn)量分別為0.44，0.37，0.41 g/L。酪丁酸梭菌ATCC25755利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸量較少，僅為0.046 g/L，這是因?yàn)樵谄浼?xì)胞代謝流向中，碳作為分子骨架偏向于合成丁酸。

圖8 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基發(fā)酵的產(chǎn)丁酸量變化

Figure 8 Changes of butyric acid production inClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricumduring fermentation on synthetic medium

圖9 丁酸梭菌和酪丁酸梭菌在合成培養(yǎng)基發(fā)酵的產(chǎn)乳酸量變化

Figure 9 Changes of lactic acid production in the synthetic medium during fermentation ofClostridiumbutyricumandClostridiumtyrobutyricum

3 結(jié)論

本研究從人糞便、窖泥和動(dòng)物腸道內(nèi)容物分離篩選出3株梭狀芽孢桿菌，并通過(guò)16S rDNA核苷酸序列鑒定均為丁酸梭菌，分別命名為ClostridiumbutyricumNK、ClostridiumbutyricumSY、ClostridiumbutyricumRX。3株丁酸梭菌具有不同的發(fā)酵特性，在合成培養(yǎng)基中，丁酸梭菌NK和丁酸梭菌RX的產(chǎn)酸能力優(yōu)于丁酸梭菌SY。另外，丁酸梭菌與酪丁酸梭菌相比較，由于種屬的差別，發(fā)酵特性差異顯著。酪丁酸梭菌產(chǎn)丁酸能力優(yōu)于丁酸梭菌。然而，丁酸梭菌的生長(zhǎng)能力和產(chǎn)乳酸能力高于酪丁酸梭菌。通過(guò)以上不同種和同種不同株的比較，為研究其代謝途徑差異提供基礎(chǔ)，以望進(jìn)一步從代謝關(guān)鍵點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)行基因改造，從而構(gòu)建出優(yōu)良的適合工業(yè)生產(chǎn)的基因工程菌。