盧永翎 陸 敏 王 茜 呂麗爽

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

蒸蛋糕因組織膨松、味道清淡不膩，近年來廣受歡迎，其主要原料為小麥粉、雞蛋、白砂糖、食用油等。蛋糕中的油脂、蛋白質(zhì)及糖類在高溫加工[1]條件下會(huì)同時(shí)發(fā)生化學(xué)和物理變化，其中美拉德反應(yīng)在賦予蛋糕理想的風(fēng)味及色澤的同時(shí)，易導(dǎo)致有害中間產(chǎn)物1,2-二羰基化合物如乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)的形成。高活性的1,2-二羰基化合物可進(jìn)一步與蛋白質(zhì)中的氨基及胍基反應(yīng)形成穩(wěn)定的晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[2]。長期攝入高含量AGEs的食物會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)AGEs水平增加[3]，產(chǎn)生一定危害，如引發(fā)糖尿病及其并發(fā)癥[4]，腎臟疾病[5]，炎癥及衰老[6]。國內(nèi)外已有研究[7]證明黃酮類物質(zhì)具有較好的抗糖基化作用，如槲皮素、柚皮素、表兒茶素等可以降低烘焙餅干中熒光性AGEs及GO的產(chǎn)生，染料木黃酮通過捕獲MGO形成加合產(chǎn)物從而降低體系中1,2-二羰基化合物的含量[8]，但同時(shí)研究實(shí)際加工體系中不同原料對1,2-二羰基化合物和晚期糖基化終產(chǎn)物影響的報(bào)道較少。

本研究擬選擇蒸蛋糕為研究對象，依據(jù)實(shí)際蛋糕加工體系，通過氣相色譜法及熒光分光光度法，探討了不同配方(糖種類、油脂種類、糕點(diǎn)酸度調(diào)節(jié)劑、蛋黃蛋清比例)對蛋糕中有害中間產(chǎn)物(GO及MGO)和終產(chǎn)物AGEs生成量的影響，研究其產(chǎn)生規(guī)律及添加食源性黃酮(木犀草素和染料木素)后對美拉德反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米油、大豆油、棕櫚油(不添加抗氧化劑)：南京邦基糧油有限公司；

植物黃油：上海高夫食品有限公司；

低筋小麥粉：深圳南海糧食工業(yè)有限公司；

白砂糖、紅砂糖、木糖醇：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；

葡萄糖、D-果糖、麥芽糖、乳糖：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

木糖：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

F55果葡糖漿：長春市正源食品有限公司；

糕點(diǎn)酸度調(diào)節(jié)劑(塔塔粉)：上海萬研食品有限公司；

染料木素、木犀草素：HPLC級(≥98%)，南京廣潤生物試劑有限公司；

乙二醛(40%水溶液)、甲基乙二醛(40%水溶液)、鄰苯二胺(99.5%)：分析純，美國sigma-Aldrich公司；

氫氧化鈉、鹽酸、二氯甲烷、乙醛、2,3-丁二酮等：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：U-3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

酶標(biāo)儀：Infinite 200 Pro型，奧地利Tecan有限公司；

冷凍離心機(jī)：Eppendorf 5415型，艾本德中國有限公司；

電子天平：FA2104N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

pH計(jì)：PHS-3C型，上海三信儀表廠；

攪拌機(jī)：HM520型，凱伍德有限公司；

電蒸鍋：WSYH26A型，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本配方及工藝流程

(1) 基本配方：蛋清部分(蛋清100 g，糖38 g，糖種類及塔塔粉用量由試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定)；蛋黃部分(低筋小麥粉36 g，果葡糖漿16 g，水10 g，油脂30 g，油脂種類、蛋黃及黃酮用量由試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定)。

(2) 工藝流程：

1.3.2 操作要點(diǎn) 取新鮮雞蛋分離蛋清和蛋黃，將蛋黃部分充分?jǐn)嚢杈鶆蛑频玫包S糊，將糖分3次加入蛋清中高速攪打至干性發(fā)泡制得蛋白霜。取1/3蛋白霜加入蛋黃糊中翻拌均勻，再將其與剩余蛋白霜拌勻后分裝到尺寸為6.3 cm×4.0 cm×2.0 cm的錫紙蛋糕模具中，每份30 g，將模具在案臺(tái)上用力震2～3次，去除內(nèi)部較大氣泡后置于電蒸鍋中蒸30 min，立即取出于室溫下冷卻。

1.3.3 蒸蛋糕GO/MGO及熒光性AGEs形成影響的因素

(1) 糖種類：在基本配方基礎(chǔ)上，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉及黃酮，選擇白砂糖、紅砂糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、木糖及木糖醇分別添加到蛋清部分，按1.3.2方法制作，冷卻后粉碎，置于-80 ℃冰箱中備用，分析樣品中GO/MGO和AGEs的含量。同一種糖做3組平行。

(2) 油脂種類：白砂糖添加量38 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉及黃酮，選擇玉米油、大豆油、棕櫚油、植物黃油分別添加到蛋黃部分，后續(xù)操作同1.3.1(1)。

(3) pH值：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加黃酮，分別添加塔塔粉0.0，0.5，1.0，2.0，3.0 g/100 g·蛋清，后續(xù)操作同1.3.1(1)。

(4) 蛋黃添加量：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，不添加塔塔粉及黃酮，分別添加蛋黃0，20，40，60，80 g/100 g·蛋清，后續(xù)操作同1.3.1(1)。

(5) 黃酮：白砂糖添加量38 g，玉米油添加量30 g，蛋黃添加量40 g，不添加塔塔粉，在配方中的蛋清部分分別添加染料木素、木犀草素，添加量分別為0.05，0.10，0.30 g/100 g。后續(xù)操作同1.3.1(1)。

1.3.4 蛋糕水分、pH值的測定

(1) 水分含量：按GB 5009.3—2010執(zhí)行。

(2) pH值：稱取0.4 g蛋糕粉碎樣品于50 mL離心管中，加入20 mL蒸餾水，渦旋3 min，室溫下放置1 h，用pH計(jì)測定上清液pH值。

1.3.5 熒光性AGEs量的測定 樣品中熒光性AGEs的提?。焊鶕?jù)文獻(xiàn)[7]修改如下，樣品經(jīng)提取后取200 μL測定Ex/Em=340/465 nm處熒光值，Gain設(shè)定為65，所有試樣均做3組平行。

1.3.6 GO、MGO的測定

(1) 樣品處理：根據(jù)文獻(xiàn)[7,9]修改如下，精確稱取0.5 g 蛋糕粉碎樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 蒸餾水，渦旋3 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液1。于離心管中加入5 mL 50%的甲醇水溶液，渦旋混勻后超聲提取(功率150 W)60 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液2，將1，2上清液合并混勻，8 000 r/min離心15 min，取2 mL上清進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

(2) 樣品衍生化：參照文獻(xiàn)[10]。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精確量取用純凈水稀釋的0.05，0.1，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL的GO和MGO混合溶液2 mL，采用1.3.6(2)的衍生化方法對標(biāo)準(zhǔn)品GO和MGO進(jìn)行衍生化，以GO或MGO的濃度為橫坐標(biāo)，GO或MGO與內(nèi)標(biāo)(2,3-丁二酮)的峰面積之比為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4) 液相色譜條件：色譜柱為kromasil 100-5 C18(250×4.6 mm id，5 μm)；檢測波長315 nm。流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為0.2%(體積比)的乙酸水溶液；洗脫程序：0～25 min：32% A；25～28 min：32%～40% A；28～36 min：40% A；36～38 min：40%～50% A；38～40 min：50%～85% A；40～48 min：85% A；48～50 min：85%～32% A；50～55 min：32% A。流速0.8 mL/min。進(jìn)樣量10 μL。柱溫30 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析(ANOVA)中Duncan進(jìn)行檢驗(yàn)(P<0.05)，不同處理的顯著性差異以不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜目標(biāo)峰分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

利用鄰苯二胺將GO、MGO及內(nèi)標(biāo)2,3-丁二酮分別衍生化為喹喔啉，甲基喹喔啉，2,3-二甲基喹喔啉。目標(biāo)峰具有很好的分離度及峰形(圖1)。通過色譜峰分別計(jì)算GO、MGO與2,3-丁二酮的峰面積之比，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線GO：y=0.026 7x+0.016，R2=0.999 2；MGO：y=0.060 8x+0.021 1，R2=0.999 5。

2.2 各因素對蒸蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs產(chǎn)生量的影響

2.2.1 糖種類 由圖2可知，不同糖產(chǎn)生的GO/MGO含量存在顯著性差異(P<0.05)，其中果糖產(chǎn)生的MGO最多，木糖產(chǎn)生的GO最多，GO與MGO產(chǎn)生總量由大到小依次為木糖、果糖、葡萄糖、紅砂糖、乳糖、麥芽糖、白砂糖、木糖醇[圖2(a)]。添加木糖和乳糖時(shí)GO產(chǎn)生量大于MGO產(chǎn)生量，添加其他糖時(shí)GO的產(chǎn)生量均小于MGO的。對于熒光性AGEs[圖2(b)]，由大到小依次為木糖、紅砂糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、白砂糖、木糖醇。不同糖產(chǎn)生的1,2-二羰基化合物總量與AGEs的排序基本一致。木糖產(chǎn)生的1,2-二羰基化合物總量及熒光性AGEs均為最高，可能是木糖為五碳糖，在美拉德反應(yīng)中五碳糖的反應(yīng)活性大于六碳糖[11]。紅砂糖產(chǎn)生的GO/MGO及熒光性AGEs的含量均大于白砂糖，源于紅砂糖比白砂糖含有較多的礦物質(zhì)、轉(zhuǎn)化糖、淀粉和葡聚糖[12]，另外，紅砂糖中金屬離子含量為白砂糖的24倍以上，金屬離子能促進(jìn)美拉德反應(yīng)[13]。因此，在蛋糕加工中盡量減少木糖或紅砂糖等高活性單糖的使用，減少其加工過程中美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

圖1 GO、MGO、2,3-丁二酮的喹喔啉衍生物色譜圖

Figure 1 The chromatogram of Quinoxaline derivatives of GO, MGO, and 2,3-butanedione

2.2.2 油脂 由圖3可知，4種油脂制作的蛋糕(玉米油、大豆油、植物黃油、棕櫚油)，MGO的產(chǎn)生量均大于GO[圖3(a)]。植物黃油產(chǎn)生的GO與MGO含量均最低，可能是因?yàn)橹参稂S油由不同植物油復(fù)配而成，在加工過程中添加了一定的抗氧化劑，如VE、特丁基對苯二酚等。研究[11]發(fā)現(xiàn)，植物黃油蛋糕中的CML含量低于植物油蛋糕。玉米油和大豆油的不飽和程度高，易于氧化[12]，GO含量高。油脂對熒光性AGEs生成量的影響[圖3(b)]由高到低依次為玉米油、大豆油、棕櫚油、植物黃油，玉米油產(chǎn)生的熒光性AGEs是植物黃油的1.4倍。由此可見，在蛋糕加工中應(yīng)選用飽和程度相對較高及添加一定抗氧化劑的油脂，以減少糖基化有害產(chǎn)物的生成量。

圖2 糖種類對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 2 Effect of sugar on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cakes

圖3 油脂對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 3 Effect of lipid species on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cakes

2.2.3 pH 新鮮雞蛋蛋清呈堿性，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，堿性會(huì)增大。塔塔粉為糕點(diǎn)的酸度調(diào)節(jié)劑，可中和蛋白的堿性，有助于蛋白打發(fā)，增加制品的韌性[14]。分別向蛋糕中添加塔塔粉(添加范圍為0.5%～2.0%)，其pH值變化如表1。

由圖4(a)可知，隨著塔塔粉添加量的增高，pH值的降低，蛋糕中GO與MGO含量呈下降趨勢(P<0.05)。塔塔粉添加量為2.0 g/100 g·蛋清時(shí)蛋糕中的GO與MGO含量比未添加的分別下降23.76%和35.68%。熒光性AGEs的生成量隨著添加量的增加(即pH值的降低)，呈下降趨勢[圖4(b)]，蛋糕顏色也逐漸變淺。如文獻(xiàn)[15]報(bào)道中性偏堿的環(huán)境下有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。因此在蛋糕生產(chǎn)過程中，添加一定量的酸度調(diào)節(jié)劑，有利于減少糖基化有害產(chǎn)物的產(chǎn)生，且有助于蛋白打發(fā)。

表1 添加塔塔粉蛋糕的pH值

圖4 塔塔粉對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 4 Effect oftartar powder on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cake

2.2.4 蛋黃 蛋黃添加到蛋糕中可穩(wěn)定泡沫，改善制品組織、延遲老化及保持產(chǎn)品良好形態(tài)[16]。由圖5可知，隨著蛋黃添加量的增加，體系中GO/MGO和AGEs的含量也呈上升趨勢。對于MGO[圖5(a)]，當(dāng)?shù)包S添加量為0～40 g/100 g·蛋清時(shí)，上升趨勢明顯；添加量為40 g/100 g·蛋清時(shí)達(dá)到最大值(12.74 μg/g)，是未添加蛋黃的1.5倍，之后維持不變。蛋黃的添加量對蒸蛋糕GO的形成影響不明顯[圖5(a)]。熒光性AGEs隨著蛋黃添加量增加(0～40 g/100 g·蛋清)而不斷上升，之后AGEs含量變化趨于平緩[圖5(b)]。蛋黃中含有32%～35%的脂肪[17]，且以單不飽和脂肪酸為主(50%以上為油酸)，蛋黃在熱加工過程中容易產(chǎn)生MGO及AGEs[18]。綜上，蛋黃添加量為40 g/100 g·蛋清時(shí)，GO/MGO和AGEs基本達(dá)到最高值；當(dāng)<40%，隨著蛋黃的添加量降低有害產(chǎn)物均顯著降低，因此蛋糕加工中在保證品質(zhì)的前提下可適當(dāng)降低蛋黃的比例。

圖5 蛋黃含量對蛋糕中GO/MGO和熒光性AGEs形成的影響Figure 5 Effect of egg yolk content on the formation of GO/MGO and fluorescence AGEs in cake

2.2.5 黃酮 由圖6可知，黃酮對蛋糕中GO/MGO及AGEs的抑制率均隨著添加量的增大而提高，呈明顯的量效關(guān)系。其中木犀草素的抑制作用略強(qiáng)于染料木素，同種黃酮在相同濃度下對GO的抑制效果明顯高于MGO。對GO，當(dāng)添加濃度為0.3%時(shí)，木犀草素抑制率達(dá)到48.15%，染料木素達(dá)到43.38%，均接近半抑制率。據(jù)報(bào)道[10,19]，黃酮通過捕獲GO/MGO從而抑制AGEs的形成。對熒光性AGEs的抑制作用見圖6(c),添加木犀草素為0.3%時(shí)，對AGEs的抑制率約達(dá)到60%。

3 結(jié)論

糖種類、油脂種類、糕點(diǎn)酸度調(diào)節(jié)劑添加量、蛋黃蛋清比例對蒸蛋糕中糖基化有害中間產(chǎn)物(GO及MGO)產(chǎn)生總量的影響與晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs基本一致。其中不同種類的糖對GO/MGO及熒光性AGEs生成量影響差異最為顯著，在加工過程中應(yīng)減少木糖或紅砂糖等高活性單糖的使用，采用添加抗氧化劑的飽和度較高的油脂，并在保證品質(zhì)的前提下適量減少蛋黃的使用量。在蛋清中添加一定量的酸度調(diào)節(jié)劑(塔塔粉)不僅可以改善蛋糕的品質(zhì)，也可以減少美拉德反應(yīng)有害產(chǎn)物的生成。添加食源性黃酮木犀草素及染料木素對蒸蛋糕中糖基化反應(yīng)均有明顯的抑制作用，但添加后蛋糕的質(zhì)構(gòu)特性及感官評定還有待進(jìn)一步深入研究。

圖6 不同種類及濃度黃酮對蛋糕體系GO/MGO和AGEs的抑制

Figure 6 Inhibition of GO/MGO in the cake system with different kinds and concentration of flavonoids