李 夢(mèng)， 胡有貞， 唐 潔， 王麗軍， 鄭曉吉， 顧艷玲， 關(guān) 波， 倪永清

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832002）

天山1號(hào)冰川凍土屬于我國(guó)高海拔高山多年凍土類型，分布于烏魯木齊河源天山冰川站及空冰斗地區(qū)，海拔3 250 m以上，年平均地溫為-4.95℃[1]。凍土環(huán)境中的微生物需要通過各種生理機(jī)制適應(yīng)低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等一系列極端環(huán)境。凍土微生物的這些極端生理特性為研究和開發(fā)利用參與代謝過程的低溫酶提供了豐富的材料。已有研究對(duì)天山1號(hào)冰川凍土中產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶的微生物進(jìn)行篩選，本課題組從天山1號(hào)冰川凍土中分離獲得產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶、低溫脂肪酶、低溫蛋白酶和低溫淀粉酶的菌株。然而，由于冰川凍土有機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)十分貧瘠，從中分離的寡營(yíng)養(yǎng)型微生物在現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)條件下普遍生長(zhǎng)速率較慢，產(chǎn)酶水平較低（僅約1～5 U/mL），嚴(yán)重限制了低溫酶的高效篩選和制備。因此，利用宏基因組學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建冰川凍土的宏基因組文庫進(jìn)行功能篩選，有助于更高效地從低溫環(huán)境中篩選β-半乳糖苷酶。

獲取高質(zhì)量的宏基因組DNA是構(gòu)建宏基因組文庫的先決條件。目前對(duì)于各類土壤微生物總DNA的提取方法已有較多的報(bào)道[2-7]，但在已經(jīng)報(bào)道的提取方法中還沒有一種方法能夠適用于所有環(huán)境樣品微生物總DNA的提取。由于冰川微生物生物量相對(duì)較低，而且主要以革蘭氏陽性菌為主[8]，本課題組前期嘗試使用商業(yè)化提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）和 PowerSoilDNA Isolation Kit（MO BIO）提取的天山1號(hào)冰川凍土DNA的得率和純度均無法滿足構(gòu)建宏基因組文庫的要求。因此，建立一種適用于天山1號(hào)冰川凍土的DNA提取方法，對(duì)構(gòu)建冰川凍土的宏基因組文庫及低溫β-半乳糖苷酶的高效篩選具有重要意義。本文對(duì)目前報(bào)道的幾種土壤DNA提取方法進(jìn)行了比較，并對(duì)最適合天山1號(hào)冰川凍土DNA提取的TEN法進(jìn)行了優(yōu)化和改良。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

天山一號(hào)冰川屬于天格爾山北坡烏魯木齊河的河源區(qū)，海拔 3 833 m（43°07.125 N，86°48.707 E）。凍土土壤樣品取自從烏魯木齊天山一號(hào)冰川尾部的底部沉積層，用提前滅菌的工具沿冰川邊緣收集土樣。采集的樣品迅速裝入已滅菌的50 mL離心管，置于車載冰箱中-4℃保存。采集的凍土樣品于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

PCR Taq酶，λ DNA/HindⅢ marker購自大連寶（Takara）生物工程有限公司，F(xiàn)astDigest快速限制性內(nèi)切酶Bam HI購自賽默飛世爾（Thermo Scientific）公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，蛋白酶K和溶菌酶購自北京康為世紀(jì)有限公司，相關(guān)生化試劑購自上海生工生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)用到的主要緩沖液及成分如下:

裂解緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaEDTA，100mmol/L Na2PO4，1.5 mol/L NaCl，10 mg/mL CTAB，pH 8.0；

TENP 溶液:50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，10 mg/mL PVPP，pH 10.0；

PBS buffer:8.0 g NaCl，2.0 g KCl，1.44 g

Na2HPO4，0.24 g KH2PO4， 溶于 1 L 去離子水，pH 7.4；

TEN 溶液:100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris（pH 8.0）， 1.5 mol/L NaCl，100 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4；

TE buffer:10 mmol/L Tris-HCl buffer（pH 8.0），1 mmol/L EDTA。

1.3 凍土微生物總DNA的提取方法

1.3.1 SDS-CTAB裂解法 參考趙裕棟等的方法[9]，略有調(diào)整。稱取5.0 g土壤樣品于50 mL離心管中，加10 mL裂解緩沖液，振蕩混勻。向樣品中加100 μL溶菌酶（質(zhì)量濃度為250 mg/mL），混合均勻，37℃恒溫水浴1 h，每15 min溫和震蕩混勻1次；加50 μL蛋白酶 K（10 mg/mL），恒溫水浴 1 h；加 100 g/L 十二烷基磺酸鈉（SDS，終質(zhì)量濃度為40 g/L），65℃水浴2 h，每20 min溫和顛倒混勻 1次；離心，取上清液，上清液中加1/5倍體積的氯仿（提前預(yù)冷），輕微振蕩混勻，25℃ 8 000 r/min離心15 min，取上清液；向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃、2 h沉淀DNA；4℃，10 000 r/min離心20 min，棄去上清液，保留 DNA沉淀。體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇洗滌沉淀3次，自然晾干，加100 μL TE溶解DNA，于-20℃保存。

1.3.2 TENP法 參考趙勇等方法[10]，略有改動(dòng)。預(yù)處理:取5.0 g土壤，于50 mL離心管中，加10 mL的TENP buffer，振蕩混勻，離心 10 min（10 000 r/min，25℃），去上清液。沉淀中再加10 mL的TENP buffer，振蕩混勻，離心 10 min（10 000 r/min，25 ℃），棄上清液。重復(fù)上述步驟直至上清透明，加入5 mL的PBS buffer按上述操作洗滌，保留沉淀。DNA提取:將收集的沉淀懸浮于10 mL裂解緩沖液 （同SDS-CTAB裂解法），37℃水浴45 min；加 50 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 100 μL 溶菌酶（250 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 2 mL 100 g/L SDS，65℃水浴 2 h。8 000 r/min、25℃離心 10 min，將上層液相轉(zhuǎn)入另一潔凈的50 mL離心管，加等體積氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），10 000 r/min、25 ℃離心15 min。取上層清液，向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃沉淀2 h；10 000 r/min、4℃離心20 min，體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇洗滌沉淀3次，洗滌后自然風(fēng)干2 h，待乙醇風(fēng)干后，加100 μL TE，得到DNA溶液-20℃保存。

1.3.3 TEN法 參考Fang等方法[11]，略有改動(dòng)。稱取5.0 g土壤樣品，加入10 mL TEN溶液，將樣品完全懸浮到TEN溶液中，反復(fù)凍融（-80℃，10 min；65℃，5 min）3 次后；再加入 100 μL 溶菌酶（250 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加入 10 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL），37℃水浴30 min。酶解后在試樣中加入2 mL預(yù)熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴2 h，期間每15 min輕輕上下顛倒一次。10 000 r/min，25℃離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，土壤顆粒裂解后沉淀于4℃保存?zhèn)溆?。向上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，體積比），混勻后，10 000 r/min，25℃離心10 min，收集水相。向水相中加入0.6倍體積的異丙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，4℃沉淀2 h，10 000 r/min、4℃離心20 min，棄上清液，體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇洗滌沉淀3次，室溫晾干，加100 μL無菌TE溶解DNA。

1.3.4 Zhou法[12]稱取5.0 g土壤樣品，研碎，于50mL離心管中，加13.5mL裂解緩沖液，振蕩混勻；加100 μL蛋白酶 K（10 mg/mL），37 ℃水浴 30 min；加 1.5 mL 200 g/L SDS，混勻，65℃水浴2 h，間或混勻；8 000 r/min、25℃離心20 min，將上層液相轉(zhuǎn)入另一潔凈的50 mL離心管于4℃?zhèn)溆?；土樣沉淀再?.5 mL裂解緩沖液和0.5 mL 200 g/L SDS混勻，于65℃，10 min后，離心；上清液與前一次上清合二為一，加等體積氯仿異戊醇抽提，8 000 r/min、離心10 min；取上層清液，加入0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h；10 000 r/min、25℃離心20 min，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀3次，自然風(fēng)干，加100 μL TE。

1.3.5 TEN法的改良和優(yōu)化 1）反復(fù)多次提取對(duì)提取效率和質(zhì)量的影響。以TEN法首次裂解后的含細(xì)胞裂解物沉淀作為第2次DNA提取樣品，按TEN法反復(fù)提取1次 （在提取樣品中加入2 mL預(yù)熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴30 min，其余不變），記為TEN1法。以第2次裂解后的含細(xì)胞裂解物沉淀作為第3次DNA提取樣品，再用TEN方法重復(fù)提取 1次，記為TEN2法。2）向TEN法首次裂解后的土壤顆粒沉淀中加入4 mL TEN溶液，并反復(fù)凍融（-80 ℃，10 min；65 ℃，5 min）3 次后，再加入1 mL預(yù)熱的100 g/L SDS，65℃恒溫水浴30 min，8 000 r/min離心15 min后的上清液與第1次離心獲得的上清液合并后，進(jìn)行核酸沉淀，后續(xù)操作方法與TEN法相同，記為TEN3法。3）預(yù)處理對(duì)提取效率和質(zhì)量的影響。取2組凍土樣品分別不進(jìn)行預(yù)處理和進(jìn)行預(yù)處理（將土壤顆粒重懸于10 mL TEN溶液中，25℃、150 r/min、10 h后，將混合物離心，收集沉淀。再重復(fù)用TEN溶液洗沉淀2～3次，直到懸浮液無色澄清）后按TEN3法提取 （預(yù)處理記為TEN4）每個(gè)處理至少做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 凍土微生物總DNA完整性及純度和得率的檢測(cè)

提取的凍土微生物核酸樣品用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定230、260、280 nm處的光吸收和核酸濃度。以A260/A280和A260/A230的比值來評(píng)價(jià)DNA的純度。此外，取10 μL提取的凍土微生物核酸樣品，1 g/mL瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE緩沖溶液，8 V/cm，45 min）檢測(cè)DNA片段的完整性和含量。

1.5 凍土微生物總DNA的PCR擴(kuò)增

以提取的凍土微生物總DNA為模板，分別擴(kuò)增16s rDNA和26s rDNA片段，分析凍土微生物總DNA 的提取質(zhì)量。 擴(kuò)增體系（20 μL）:10×Taq PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物（表 1）各 1 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，凍土微生物總DNA溶液1 μL，其余用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)的陰性對(duì)照用無菌雙蒸水代替DNA模板。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s；56℃退火 30 s；72℃延伸 1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)在PCR儀（TC512型，英國(guó)Techne公司）上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1.0 g/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物Table 1 Primes sequences and PCR product

1.6 凍土微生物總DNA的限制性酶切

凍土微生物總DNA的酶切按照FastDigest快速限制性內(nèi)切酶Bam HI的推薦酶切體系進(jìn)行酶切，在37℃水浴酶切指定時(shí)間后，80℃，5 min滅活后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

表2 不同提取方法獲得的DNA得率和純度比較Table 2 Comparison of yield and purity of DNA obtained by different extraction methods

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍土微生物總DNA提取方法的比較

土壤 DNA的得率和純度是評(píng)價(jià)DNA提取方法的2個(gè)重要指標(biāo)。4種方法所提DNA的含量和純度的測(cè)定結(jié)果見表2。從表2中可以看出，3次平行實(shí)驗(yàn)中TEN法提取DNA的得率最高，為（392±44）ng/g凍土。SDS-CTAB法和TENP法的得率最低。與一般土壤中 DNA 得率（95.67 ±1.56） μg/g土壤相比[10]，凍土中DNA的得率明顯偏低，這可能由于冰川凍土中微生物生物量較低或凍土微生物細(xì)胞的裂解效率較低。從表2中可以看出，4種提取方法所得DNA的A260/A230比值均小于1.0，說明提取DNA中雜質(zhì)成分仍較多。從A260/A280上看，TEN法提取DNA的A260/A280的比值最接近理想指標(biāo)。

利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)4種提取方法所提DNA進(jìn)行了完整性檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。除了TENP法外，其余的3種方法提取的DNA電泳后均得到明顯的主條帶，主條帶相對(duì)分子質(zhì)量在 10×103～23×103之間。

圖1 不同方法提取的凍土基因組DNA凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis result of genomic DNA extracted from frozen soil samples by different methods

4種提取方法都有不同程度的降解現(xiàn)象，但TEN法的主條帶最亮。綜合考慮不同提取方法獲得DNA的得率、完整性和純度，本研究選擇TEN法做了進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 TEN法反復(fù)多次提取DNA和改良TEN法的得率和純度分析

為了進(jìn)一步提高TEN法的DNA提取得率，用TEN法對(duì)同一份天山冰川凍土樣品進(jìn)行了反復(fù)提取，同時(shí)采用改良后的TEN3法提取。TEN3法和反復(fù)提取3次后的DNA得率及純度匯總在表3。同一樣品反復(fù)通過TEN法進(jìn)行提取3次獲得的DNA（對(duì)應(yīng) TEN、TEN1、TEN2） 得率依次為 （383±57）、（410±72） ng/g和（61±15） ng/g凍土，而 A260/A280逐漸升高，這表明單次提取無法完全獲得凍土樣品中的所有DNA，反復(fù)多次提取同一樣品后DNA中的雜質(zhì)成分逐漸減少。TEN3法參考Zhou法將2次細(xì)胞裂解產(chǎn)物合并進(jìn)行DNA抽提，得率達(dá)到（413±91）ng/g 凍土，A260/A280和 A260/A230分別為（1.76±0.04）和（1.08±0.24）。對(duì)所提基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，提取的DNA電泳后均得到較清晰的主條帶，相對(duì)分子質(zhì)量接近23×103。但由于凍土土壤中微生物的分布存在著不均一性，而在提取過程中可能又因物理機(jī)械剪切的作用而使基因組DNA有不同程度的降解。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)TEN3法進(jìn)行了優(yōu)化。

表3 TEN法反復(fù)多次提取DNA和TEN3法的得率和純度Table 3 DNA yield and purity extracted by the TEN method repeatedly and TEN3 method

圖2 TEN3法和TEN法反復(fù)多次提取凍土的基因組DNA凝膠電泳Fig.2 Electrophoresis result of genomic DNA repeatedly extracted from frozen soil samples by different TEN method

2.3 樣品預(yù)處理對(duì)DNA提取得率和純度的影響

為分析預(yù)處理步驟是否能夠提高TEN法提取DNA的得率和純度，分別取3份凍土樣品進(jìn)行預(yù)處理，3份凍土樣品不進(jìn)行預(yù)處理提取總DNA。從表4可以看出，相比未經(jīng)預(yù)處理樣品，經(jīng)預(yù)處理的樣品提取 DNA的得率從 （424±76）ng/g凍土增加到（449±61）ng/g。未經(jīng)預(yù)處理提取的DNA和預(yù)處理提取DNA的A260/A280均在1.8～2.0之間，但預(yù)處理提取的DNA其A260/A230值達(dá)到了2.03±0.31。

表4 TEN3法預(yù)處理對(duì)DNA得率與純度的影響Table 4 Effects of pretreatment with TEN buffer on the DNA yield and purity

2.4 改良TEN法提取DNA質(zhì)量的PCR檢測(cè)和限制性酶切檢測(cè)

為驗(yàn)證提取的DNA質(zhì)量是否滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，采用16S rDNA和26S rDNA引物PCR擴(kuò)增進(jìn)一步驗(yàn)證了提取的凍土宏基因組DNA質(zhì)量（圖3）。結(jié)果顯示4種方法提取的DNA樣品均可成功擴(kuò)增出16S rDNA產(chǎn)物，但SDS-CTAB法、Zhou法和TENP法提取的部分DNA樣品沒有成功擴(kuò)增出26S rDNA產(chǎn)物。采用TEN方法反復(fù)多次提取的DNA樣品均能成功擴(kuò)增出16S rDNA和26S rDNA產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳條帶單一，分別約為1 400 bp和500 bp，與預(yù)期大小一致。

圖3 16S rDNA和26S rDNA引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification using 16S rDNA and 26S rDNA primers

分別對(duì)TEN3法、TEN4法和TEN1法獲得的DNA樣品進(jìn)行限制性酶切，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示經(jīng)Bam HI部分酶切后TEN3法基因組DNA的主條帶降解不明顯，而TEN1法提取基因組DNA和TEN4法的主條帶降解明顯，表明TEN1法和TEN4法獲得的DNA滿足限制性酶切的要求。進(jìn)一步驗(yàn)證了，增加預(yù)處理的方法可以提高核酸的得率和純度。但由于通過綜合考慮到TEN4法核酸的得率相對(duì)較高，損失較少，更能展示生物的多樣性，所以采用TEN4法從天山1號(hào)冰川凍土中提取的總基因組DNA質(zhì)量滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖4 提取凍土基因組DNA的限制性酶切分析Fig.4 Restriction digestion analysis of genomic DNA extracted from frozen soil samples

3 討論

天山1號(hào)冰川凍土環(huán)境中的微生物通過產(chǎn)生低溫酶等多種機(jī)制適應(yīng)低溫環(huán)境，這為挖掘各類低溫酶提供了極好的研究材料。課題組已從天山1號(hào)冰川凍土中分離獲得產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶、低溫脂肪酶、低溫蛋白酶和低溫淀粉酶的菌株[13-16]。據(jù)估計(jì)，環(huán)境樣品中可分離培養(yǎng)微生物僅占總微生物的1%，通過現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法無法進(jìn)行培養(yǎng)微生物的種類更占到環(huán)境中所有微生物種類的99%以上[8]。近年來，極端微生物的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，特別是它們所具有的獨(dú)特基因[17-19]。冰川凍土由于有機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)十分貧瘠，分離獲得的低溫微生物在現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)條件下普遍生長(zhǎng)速率較慢，產(chǎn)酶水平較低（僅約1～5 U/mL），嚴(yán)重限制了低溫酶的高效篩選和制備。因此，需要采用基于宏基因組文庫的分子生物學(xué)方法更高效的從天山冰川凍土中挖掘酶學(xué)特性優(yōu)良的低溫酶，并構(gòu)建相應(yīng)的基因工程菌以實(shí)現(xiàn)低溫酶的高效制備。

構(gòu)建宏基因組文庫的重要前提是獲取高質(zhì)量的宏基因組DNA。盡管目前針對(duì)多種土壤樣品都有相應(yīng)的DNA提取解決方案，但還尚未報(bào)道一種可適用于所有土壤的高效方法。課題組前期采用商業(yè)化提取試劑盒 （MP Biomedicals公司的FastDNA SPIN Kit for Soil和MO BIO公司的PowerSoil DNA Isolation Kit）進(jìn)行提取發(fā)現(xiàn)，試劑盒提取單次土壤樣品處理量?。?.5 g提取樣），并且提取的天山1號(hào)冰川凍土DNA無法滿足構(gòu)建宏基因組文庫的要求并且價(jià)格昂貴。因此，本文以天山1號(hào)冰川凍土為提取材料，對(duì)現(xiàn)有的幾種土壤DNA提取方法進(jìn)行了比較，并從中選擇了DNA提取純度和得率相對(duì)較高的TEN法進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化和改良。

土壤DNA的手提方法通常包括直接法和間接法兩類，間接法通常從土壤樣品中回收細(xì)胞后再提取DNA，純度高但得率低，往往不能包括真菌和細(xì)菌總DNA[7]。直接法是直接裂解土壤樣品中的微生物，通常包括預(yù)處理、細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)抽提和DNA沉淀幾個(gè)基本環(huán)節(jié)。為了獲得較高的DNA提取效率，通常采用預(yù)處理過濾除掉一些大的顆粒雜質(zhì)，并利用預(yù)處理液中的CTAB或PVPP等成分充分吸收土壤中的腐殖酸等雜質(zhì)[12]。本研究中TENP法將PVPP加入預(yù)處理中，結(jié)果核酸的純度和得率并不理想。推測(cè)可能是由于預(yù)處理液中殘留的PVPP阻礙了后續(xù)的微生物細(xì)胞裂解，導(dǎo)致DNA提取得率最低。

為了獲得最佳的細(xì)胞裂解效果，許多研究都采用物理、化學(xué)和水解酶類聯(lián)用進(jìn)行細(xì)胞裂解[9]。本研究（SDS-CTAB法）發(fā)現(xiàn)單純采用CTAB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，效果并不好；Zhou法DNA的得率和純度也并不理想；而TEN法主要通過溶菌酶+蛋白酶K+反復(fù)凍融+SDS破碎裂解細(xì)胞，把物理、生物和化學(xué)的方法結(jié)合起來，提高了細(xì)胞的裂解效率，在4種手提方法中TEN法提取的DNA得率最高，純度也相對(duì)較高（表2）。DNA粗可體液通過吸附柱等方法進(jìn)一步純化，但通常對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量DNA的吸附具有一定的選擇性，不利于宏基因組文庫的構(gòu)建[5]，因此本研究綜合考慮DNA的純度和完整性，選擇TEN法進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化和改良。

已有文獻(xiàn)表明同一土壤樣品反復(fù)提取3次后能夠較好地表征土壤微生物的數(shù)量和物種組成，現(xiàn)有的DNA提取方法似乎很難一次性將所有土壤微生物細(xì)胞裂解并獲得DNA[20-21]。本研究的結(jié)果也表明反復(fù)提取3次均能從天山1號(hào)冰川凍土樣品中提取出不同含量的DNA，但以TEN1法的得率和純度最高。TEN3法則參考了Zhou法中一次提取過程將2次細(xì)胞裂解物成分合并后一并進(jìn)行DNA抽提的策略，所提DNA的總體得率不如分2次提?。═EN+TEN1）的總得率高，但由于進(jìn)行了多批次細(xì)胞裂解，所提DNA更能體現(xiàn)凍土中微生物的天然組成。因此，最終選擇了TEN3法的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Fang等提取河床沉積物DNA時(shí)發(fā)現(xiàn)TEN法預(yù)處理有助于提高DNA的純度和得率[12]，本文的結(jié)果也表明預(yù)處理后TEN法提取的凍土DNA其A260/A230值達(dá)到了（2.03±0.31），提取DNA的純度明顯提高。

16S rDNA和26S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示預(yù)處理改良TEN法提取的DNA質(zhì)量相對(duì)較高，表明該方法能從凍土中同時(shí)有效提取細(xì)菌和真菌總基因組DNA。預(yù)處理改良TEN法提取DNA的限制性酶切效果明顯，提取所獲得DNA滿足構(gòu)建天山冰川凍土微生物宏基因組文庫的要求。

4 結(jié) 語

本研究通過對(duì)現(xiàn)有幾種土壤樣品DNA提取方法的比較和優(yōu)化，建立了一種適合天山1號(hào)冰川凍土樣品微生物總DNA提取的有效方法——預(yù)處理改良TEN法，為后續(xù)天山1號(hào)冰川凍土宏基因組文庫的構(gòu)建和低溫乳糖酶的篩選奠定了基礎(chǔ)。