牛 麗 ， 巴永兵 ， 白鳳佳 ， 劉海泉 ，2，3，4， 潘迎捷 ，2，3， 趙 勇 *，2，3

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolytic us）是存在于魚、蝦、蟹和海藻中的嗜鹽菌，也是重要的食源性致病細菌[1-3]，食用被該菌污染的水產品輕則嘔吐、腹瀉，重則引起急性胃腸炎和原發(fā)性敗血癥等疾病[4]。我國食源性疾病監(jiān)測網的數(shù)據(jù)顯示，由微生物污染導致的食源性疾病事件中，副溶血性弧菌起主要原因，也是我國細菌中毒的重要原因[5-7]。

抗生素的濫用導致微生物產生耐藥性，微生物的耐藥性已經成為全球范圍內極其嚴重的公共衛(wèi)生安全問題[8]。由于抗生素廉價、可以快速治療由食源性致病細菌引起的疾病，使得我國抗生素使用情況較為嚴重[2]。研究表明，由于抗生素的使用不當，細菌對其耐藥程度逐年增加[9]。細菌耐藥性指細菌對于抗生素藥物作用的耐受程度，分為2種方式表達。一種是抗生素抗性表型:指抗菌藥物本身的化學污染使細菌機體內對其產生耐藥性；另一種是抗生素抗性基因 （Antibiotic Resistance Genes，ARGs）型:指抗生素的濫用會對細菌產生選擇性的壓力，可能會導致機體體內出現(xiàn)ARGs。ARGs首次被Pruden等[10]于2006年提出作為環(huán)境中的新型污染物。2011年4月7日世界健康日，世界衛(wèi)生組織強調微生物對抗生素產生耐藥的重要性，呼吁積極采取措施應對微生物耐藥性[11]。

目前很少有人比較不同來源以及不同致病性的食源性細菌對藥物的耐藥情況，過去國內外有關于副溶血性弧菌（VP）以及其他食源性致病細菌耐藥性研究，然而只聚焦在細菌耐藥性普查，而對于菌株本身的屬性（基因型、菌株來源）研究較少[13-15]。本研究系統(tǒng)的通過6大類抗生素抗性表型和基因型普查來比較不同來源以及不同基因型副溶血性弧菌耐藥性差異，為副溶血性弧菌耐藥多樣性研究提供基礎數(shù)據(jù)，并對進一步研究耐藥菌風險評估提供相關的幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株的獲得

菌株信息如表1所示，從上海市某水產品市場分離得到44株副溶血性弧菌，其中22株副溶血性弧菌由海水蝦分離（南美白對蝦分離（12株），斑節(jié)蝦分離（4株），羅氏沼蝦分離（4株），白米蝦分離（1株），基圍蝦分離（1株）得到，另外22株副溶血性弧菌分離自淡水蝦（羅氏沼蝦分離（12株），日本沼蝦（9株），南美白對蝦（1株））。通過使用PCR檢測其非致病基因tlh、致病基因tdh和trh（方法參照Kaysner and DePaola（2001））[15]，有 19 株致病性副溶血性弧菌（含tlh+/tdh+/trh-基因的9株，含tlh+/tdh-/trh+10 株），25 株非致病性菌株（tlh+/tdh-/trh-）。

1.2 菌株耐藥性檢測方法

菌株抗生素抗性表型檢測:使用改良后的K-B紙片擴散法[6]，從-80℃保存的體積分數(shù)25%甘油管中吸取少量菌液劃線至選擇性培養(yǎng)基TCBS（北京陸橋技術有限責任公司），37℃培養(yǎng)16~18 h，挑單菌落接種至10 mL胰蛋白胨大豆肉湯 （3 g/dL NaCl，pH 8.0，北京陸橋技術有限責任公司）進行活化，37℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)18 h?？股乜剐员硇蜋z測質控菌為Escherichia coli ATCC25922。參考之前本實驗室已有的方法[17]，用棉拭子蘸取一定濃度的菌液均勻涂布到MHA平板上，等MHA平板晾干后，將一定濃度的藥敏紙片（表2）貼在上面，3個平行，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18 h后，根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）規(guī)定[16]，測量菌株抑菌圈的直徑（mm），判斷菌株為耐藥（resistant）、中介（intermediate）以及敏感（sensitive）3 種類型。

菌株耐藥基因型監(jiān)測:采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物（北京）有限公司產品）進行樣品DNA的提取，用酶標儀 （BioTek，Synergy 2）A260/A280值檢測DNA提取的純度與濃度，結果A260/A280值在1.8~2.0之間，說明DNA純度較高，可以用

于實驗?？股乜剐曰蛉绫?所示，對這些目的基因進行擴增，其引物序列、反應體系、退火溫度參考本實驗室方法[17]，產物用普通凝膠電泳初步檢測，并將樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，經過 NCBI官網 blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比對，同源性97%以上確認為目的片段。

表1 副溶血性弧菌菌株信息Table 1 Information of Vibrio parahaemolytic us strains

表2 抗生素與抗性基因種類Table 2 Antibiotics and resistance genes

1.3 多重耐藥指數(shù)

多重耐藥菌 （Multidrug antimicrobial resistant bacteria，MDR）指菌株對3類或3類以上的抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥性[18-20]。多重耐藥指標（Multiple antimicrobial resistance index，MAR index） 于 1983年被Krumperman首次提出，反映了抗生素污染程度及評估對人類健康存在的潛在威脅，當MAR index超過0.2，表明可能所分離的菌株已經受到高風險的源頭污染，從而導致對人體健康產生潛在的風險[18]。

式（1）中:Y 為多重耐藥指數(shù)（MAR index）；A 為菌株對其具有抗性的抗生素的數(shù)量；B為菌株暴露抗生素的數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 淡水蝦來源VP與海水蝦來源VP耐藥情況比較

2.1.1 淡水蝦與海水蝦來源VP耐藥表型多樣性比較 44株副溶血性弧菌耐藥表型如圖1所示:菌株對9種抗生素抗性表現(xiàn)為耐藥，占所檢測抗生素的一半。其中，對氨芐西林有極高的耐藥性，耐藥率在97.8%，對氨基糖苷類抗生素中鏈霉素表現(xiàn)耐藥（11.36%），中介（70.45%），相比較卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素抗生素檢出率較高，和新的一線抗菌藥物如喹諾酮類和廣譜頭孢菌素類抗菌藥物比較，少數(shù)副溶血弧菌菌株對這些抗生素已經表現(xiàn)出耐藥[21-22]，在此次研究中只有少量分離菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星表現(xiàn)中介，而對于頭孢他啶、頭孢噻圬沒有抗性，與Y.Jiang[22]研究一致。

海水蝦分離的菌株至少對一種抗生素（氨芐西林）表現(xiàn)為抗性，而22株淡水蝦分離的菌株對抗生素檢出率為95.5%，其中VP25對氨芐西林抗生素抗性表現(xiàn)為敏感。13.6%的海水分離菌株對慶大霉素耐藥，相比較8.3%的淡水來源的菌株對慶大霉素耐藥比例較高；海水蝦分離株對阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥性高于淡水蝦分離株；但是，對于鏈霉素、頭孢唑林耐藥率較高為淡水分離菌株，耐藥率分別為41.7%、20.8%，同時對哌拉西林、卡那霉素耐藥率，淡水分離菌株多于海水分離菌株。經spss19.0分析，淡水和海水蝦中分離的菌株對耐藥表型差異不顯著（p＞0.05）。

圖1 淡水與海水蝦來源VP耐藥表型結果Fig.1 Results of antimicrobial resistance phenotype of Vibrio parahaemolytic us isolates from freshwater and seawater shrimp

2.1.2 淡水蝦與海水蝦來源VP耐藥基因型比較本研究使用PCR方法檢測22株淡水蝦和22株海水蝦分離副溶血性弧菌ARGs檢出率。結果圖2所示 ，38 種 ARGs 其 中 8 種 （strA、floR、strB、sulII、tetB、sulI、gryA、aadA）被檢出，其中無 β-內酰胺類ARGs檢出，本結果與婁陽[17]、Yutaka Y[24]、Letchumanan V[25]研究一致，其在探究副溶血性弧菌ARGs存在時，β-內酰胺類ARGs未被檢出。與之相反，香港水產品分離的副溶血性弧菌中，93%的菌株檢測含有超光譜β-內酰胺酶，Yutaka Y.發(fā)現(xiàn)蝦池中分離的霍亂檢測出CARB，可能與地區(qū)差異有關[21，24]。淡水蝦和海水蝦分離的菌株均檢出氨基糖苷類（strB、aadA）、喹諾酮類（gryA）、四環(huán)素類（tetB）、磺胺類（sulI、sulII）、氯霉素類（floR）ARGs，其中 sulI、gryA、aadA陽性率100%。淡水蝦分離的菌株中，strA抗性基因僅在淡水來源分離的VP5、VP7中檢出，其中VP5攜帶8種抗性基因，是攜帶ARGs最多的菌株，海水蝦分離的菌株攜帶的ARGs最多為7種。由此可見，淡水蝦分離出的菌ARGs數(shù)量和檢出率較高，整體上不同來源蝦分離的副溶血性弧菌ARGs種類和數(shù)量沒有顯著差異（p＞0.05），與上述抗生素抗性表型結果一致。

圖2 淡水和海水蝦分離的VP耐藥基因型Fig.2 Results of antimicrobial resistance genes of Vibrio parahaemolytic usisolatesfrom freshwaterand seawater

2.2 非致病VP與致病性VP耐藥情況比較

2.2.1 非致病VP與致病性VP耐藥表型多樣性比較 19株致病性副溶血性弧菌（含tlh+/tdh+/trh-基因的9株，含tlh+/tdh-/trh+10株），25株非致病性（tlh+/tdh-/trh-）菌株。 圖 3（a）可以看出致病性細菌部分對4種抗生素（氨芐西林、鏈霉素、阿米卡星、哌拉西林）耐藥，而非致病性菌株部分對氨芐西林、鏈霉素、阿米卡星耐藥，圖3（a）和表3發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌中致病性菌株占70.4%，32%非致病性菌株為多重耐藥菌株，由此可見攜帶TDH和TRH菌株多重耐藥現(xiàn)象嚴重。圖3（b）中用改良K-B紙片法[6]對18種抗生素進行檢測，其中對9種抗生素表現(xiàn)為耐藥，攜帶tlh+/tdh-/trh-菌株對所檢出抗生素種類多，耐藥率總體上相比較略低；攜帶tlh+/tdh+/trh-基因的菌株對氨芐西林（100%）、阿米卡星（44%）、慶大霉素（22.2%）、哌拉西林（22.2%）耐藥率較高；攜帶tlh+/tdh-/trh+的菌株在鏈霉素體現(xiàn)出優(yōu)勢菌株，耐藥率達到90%?？傊?，對于抗生素的耐藥性，攜帶tlh+/tdh+/trh-基因的菌株耐藥率略高。

2.2.2 非致病VP與致病性VP耐藥基因型多樣性比較 所檢測的44株副溶血性弧菌均有檢出氨基糖苷類 （strB、aadA）、四環(huán)素類 （tetB）、喹諾酮類（gryA）、氯霉素類（floR）、磺胺類（sulI、sulII）抗生素抗性基因，與不同來源菌株結果相一致，strA抗生素抗性基因僅在非致病性副溶血性弧菌檢出，致病性副溶血性弧菌strB抗生素抗性基因耐藥率明顯高于非致病菌株，但是通過spss19.0分析，不同基因型副溶血性弧菌ARGs檢出沒有顯著差異（p＞0.05）。

圖3 不同基因型副溶血性弧菌耐藥表型分析Fig.3 Analysis of antibiotic resistant phenotypes of different genotype of Vibrio parahaemolytic us

圖4 不同致病性副溶血性弧菌抗生素抗性基因分析Fig.4 Results of antimicrobial resistance genes of ifferent genotype of Vibrio parahaemolytic us

2.3 多重耐藥性分析

多重耐藥菌 （Multidrug antimicrobial resistant bacteria，MDRO）指菌株對3類或3類以上的抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥的細菌[18-20]。淡水分離株最多對7種抗菌藥物耐藥，而海水分離株最多對6種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥，可以得出不同蝦類分離的副溶血性弧菌其耐藥性沒有顯著差異，但是致病性菌株多重耐藥性高達73.7%顯著高于非致病性菌株16%（表3）。超過（39.1%）副溶血性弧菌為多重耐藥菌株，Jiang Y[23]在海參中分離的弧菌中56.2%為多重耐藥菌株，Jun JW[26]在韓國不同水產品中分離的副溶血性弧菌均表現(xiàn)多重耐藥情況，說明本研究從蝦中分離的菌株對抗生素的耐藥程度不是很嚴重，但是還應合理使用抗生素。副溶血性弧菌多重耐藥菌株的出現(xiàn)對治療其引起的疾病帶來嚴重的臨床問題，并對公共健康和海洋生物生態(tài)多樣性產生嚴重的威脅。根據(jù)以上結果，副溶血性弧菌多重耐藥情況應該引起重視。

表3 副溶血性弧菌耐藥表型、多重耐藥（Multiple antimicrobial resistance，MAR）MAR index、耐藥基因型比較研究Table 3 Compare phenotype，multiple antimicrobial resistance （MAR） index and genotype of Vibrio parahaemolytic us isolates

3 結語

目前，由于抗生素的濫用、亂用引起了細菌耐藥性的問題，細菌的耐藥性已經成為全球范圍內極其嚴重的公共衛(wèi)生安全問題。本研究通過使用改良K-B紙片法和PCR的方法分別對不同來源和不同基因型副溶血性弧菌抗生素表型和基因型進行檢測，結果表明:不同來源蝦類分離的副溶血性弧菌其耐藥性沒有顯著差異，但是致病性菌株多重耐藥性高達73.7%顯著高于非致病性菌株16%；6大類耐 藥 基 因 中 floR、strB、sulII、tetB、sulI、gryA、aadA、strA被檢出，其中strA僅在淡水蝦分離的菌株和非致病性菌株中檢出。

比較抗生素抗性表型與耐藥基因，淡水蝦分離菌株與海水蝦分離菌株其耐藥表型及耐藥基因型沒有明顯差別；致病和非致病性菌株耐藥基因型也沒有明顯區(qū)別，但是攜帶致病基因的菌株抗生素抗性表型多重耐藥明顯大于非致病性菌株，可能對人類健康存在潛在威脅，危害性強，本次結果為致病性副溶血性弧菌耐藥性風險評估提供基礎數(shù)據(jù)，應該引起人們重視，后續(xù)對于攜帶致病基因菌株多重耐藥性大于非致病菌株需要深入研究。所檢測的6大類18種抗生素和38種耐藥基因，發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，抗生素抗性表型和抗生素耐藥基因型不存在一一對應的關系。其中菌株對磺胺類抗生素（SXT）、四環(huán)素抗生素（TET）抗性表型均為敏感，但是對其所對應的耐藥基因型均有檢出。后續(xù)對這些抗性表型與耐藥基因不一致的副溶血性弧菌進行深入研究，以探究表型與基因型不一致的機理。