陳思翔 趙凡 葉妙勇 朱晨鋒 趙劍鋒 黃曉軍

陰莖海綿體內(nèi)氧含量與勃起功能有著密不可分的聯(lián)系。目前研究認(rèn)為，低氧是勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。根治性盆腔手術(shù)（如根治性前列腺切除術(shù)）后患者常常會(huì)發(fā)生神經(jīng)性ED，而低氧與其生理、病理變化有關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，因根治性前列腺切除術(shù)所致的ED，最主要的發(fā)病原因是海綿體神經(jīng)（cavernous nerve，CN）損傷后，患者夜間生理性勃起受到影響，海綿體內(nèi)組織缺氧，從而導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）損傷和海綿體纖維化[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SD大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)切除后，CCSMC中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和膠原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）表達(dá)升高，CCSMC發(fā)生了缺氧和表型轉(zhuǎn)化[5]。一些有關(guān)ED發(fā)生機(jī)制的研究提示，MAPK信號(hào)通路在其中有著舉足輕重的地位[6]。但是，低氧狀態(tài)下CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化與MAPK信號(hào)通路之間是否存在聯(lián)系，目前尚未可知。本研究通過低氧干預(yù)CCSMC，觀察低氧狀態(tài)下大鼠CCSMC表型轉(zhuǎn)化及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，以探討低氧環(huán)境對(duì)大鼠CCSMC表型轉(zhuǎn)化及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠1只，6周齡，體質(zhì)量170g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 主要試劑 DMED/F-12高糖培養(yǎng)液、FBS（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ（美國(guó)Sigma公司），4%多聚甲醛、Trtion X-100、異硫氰酸熒光素（SABCFITC）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶（HRP）（武漢博士德生物工程有限公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白定量試劑盒（杭州碧云天公司），兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、兔抗肌間線蛋白（Desmin）、兔抗 β-Actin（杭州華安生物技術(shù)有限公司），兔抗CollagenⅠ（美國(guó)Immunoway公司），兔抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1/2）及兔抗p-ERK1/2、兔抗p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及兔抗p-p38 MAPK、兔抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）及兔抗p-JNK（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），混合氣體1%O2＋5%CO2＋94%N2（杭州今工物資有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCSMC培養(yǎng) 采用酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞[7]。采取頸椎脫臼法將SD大鼠迅速處死，置入75%乙醇中浸泡5min，轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺(tái)中，迅速切取陰莖于無菌培養(yǎng)皿中，用4℃預(yù)冷的PBS沖洗陰莖組織2次。在PBS中去除龜頭部分，仔細(xì)剝除陰莖外周皮膚、白膜以及尿道海綿體、海綿體間隔和血管。PBS漂洗3次，剪成1mm×1mm×1mm的體積均勻的組織塊，然后放入含0.5%膠原酶Ⅰ溶液的1.5ml離心管中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱3～4h，使組織塊基本消化完畢。1 000r/min離心5min，棄上清液，在沉淀中加入1ml已配制好的含20%FBS的DMEM/F12高糖培養(yǎng)液，吹打均勻，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后，鏡下可見貼壁生長(zhǎng)的平滑肌細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，然后換含10%FBS的DMEM/F12高糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均在4代以內(nèi)。

1.3.2 CCSMC鑒定 采用免疫熒光法鑒定CCSMC[8-9]。按2×104/ml濃度將CCSMC鋪于24孔板中（24孔板中預(yù)先放入無菌圓型蓋玻片），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，10min/次；加入4%多聚甲醛，4℃固定 15min，PBS 洗 3 次，10min/次；用0.5%Trtion X-100室溫破膜處理15min，PBS洗3次，10min/次；血清封閉液室溫封閉1h，分別加入兔抗α-SMA（1∶200）和兔抗 Desmin（1∶200）4℃過夜；PBS 洗 3次，10min/次，生物素化二抗（1∶100）置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30min；PBS洗3次，10min/次，加入SABCFITC（1∶100）室溫避光孵育 2h；PBS 洗 3 次，10min/次，加入 DAPI（0.5μg/ml）室溫避光孵育 15min；PBS 洗 3次，10min/次，取出蓋玻片置于載玻片上，并用抗熒光衰減封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 細(xì)胞低氧處理 參照Wu等[10]提出的方法進(jìn)行細(xì)胞低氧處理。按3×104/ml濃度將CCSMC鋪在6孔板中；待第2天細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后換液；低氧組放入缺氧小室，通入混合氣體（1%O2＋5%CO2＋94%N2）；再將缺氧小室放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，低氧培養(yǎng)48h。同時(shí)常氧組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.3.4 CCSMC表型轉(zhuǎn)化及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。收集1.3.3培養(yǎng)的細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含PMSF 1mmol/L），于冰上裂解30min，12 000r/min離心15min，取上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴變性15min，用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（80V，30min；120V，90min），然后切下含有目的蛋白條帶的凝膠條，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上（分子質(zhì)量較小：200mA，120min；分子質(zhì)量較大：200mA，150min）。用 5%脫脂奶粉于搖床上室溫封閉2h，TBST搖床洗膜3次，10min/次；分別加入兔抗 α-SMA（1∶1 000）、兔抗 CollagenⅠ（1∶1 000）、兔抗 ERK1/2（1∶1 000）及兔抗 p-ERK1/2（1∶1 000）、兔抗 p38 MAPK（1∶1 000）及兔抗 p-p38 MAPK（1∶1 000）、兔抗 JNK（1∶1 000）及兔抗 p-JNK（1∶1 000）和鼠抗 β-actin（1∶1 000），4℃搖床孵育過夜。TBST 搖床洗膜3次，10min/次；分別對(duì)應(yīng)加入兔抗和鼠抗二抗（1∶15 000），搖床室溫避光孵育2h，TBST搖床洗膜3次，10min/次。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算HIF-1α、CollagenⅠ、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量；以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值，即p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCSMC鑒定結(jié)果 細(xì)胞分離培養(yǎng)第2天在顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，多數(shù)呈長(zhǎng)梭形。選取4代內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，在熒光顯微鏡下觀察抗α-SMA和抗Desmin免疫熒光均為陽性，細(xì)胞核DAPI染色為藍(lán)色。將圖1中a與b融合得到c，d與e融合得到f，可觀察到大部分細(xì)胞，且細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)重合在一起，由此證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是同種細(xì)胞，即CCSMC。

圖1 CCSMC的免疫熒光鑒定（a：采用抗α-SMA免疫熒光染色；b：使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色；c：a與b融合得到；d：采用抗Desmin免疫熒光染色；e：使用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色；f：d與e融合得到；免疫熒光，×100）

2.2 低氧干預(yù)48h后CCSMC的形態(tài)學(xué)變化 常氧條件下培養(yǎng)的CCSMC多呈長(zhǎng)梭形，見圖2a；而經(jīng)低氧干預(yù)48h后，CCSMC形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞體趨向肥大，見圖2b。

圖2 常氧與低氧干預(yù)48h后CCSMC形態(tài)學(xué)觀察（a：常氧條件下；b：低氧條件下；倒置顯微鏡，×100）

2.3 低氧狀態(tài)下CCSMC表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 經(jīng)低氧干預(yù)48h后，HIF-1α、CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.04、0.49±0.07，較常氧組的0.12±0.01、0.29±0.04均明顯升高（均P＜0.05）；α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.04，較常氧組的0.47±0.02明顯降低（P＜0.05），見圖 3。

2.4 低氧狀態(tài)下CCSMC MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 經(jīng)低氧干預(yù)48h后，p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 0.27±0.05、0.38±0.28，較常氧組的0.42±0.09、0.58±0.27 均明顯降低（均P＜0.05）；p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.25，與常氧組的0.74±0.23比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

CN損傷后會(huì)影響男性夜間生理性勃起，從而引起CCSMC損傷和海綿體纖維化；在這過程中，缺氧是關(guān)鍵[3-4]。相關(guān)研究表明，慢性缺氧性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、睡眠呼吸暫停綜合征、慢性阻塞性肺病等，可造成不同程度的夜間生理性勃起損害[11-13]。表型轉(zhuǎn)化，源自血管平滑肌細(xì)胞研究領(lǐng)域的概念，多次被用于闡述CCSMC表型轉(zhuǎn)化與ED關(guān)系的類推證據(jù)[14-16]。目前，國(guó)內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)正圍繞表型轉(zhuǎn)化與ED的關(guān)系展開一系列研究，國(guó)內(nèi)以呂伯東團(tuán)隊(duì)、韋安陽團(tuán)隊(duì)為主。呂伯東團(tuán)隊(duì)通過低氧干預(yù)CCSMC不同時(shí)間來觀察CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的變化規(guī)律，最終認(rèn)為低氧干預(yù)48h是誘導(dǎo)CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化最顯著的時(shí)間[17]。同時(shí)，呂伯東團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)低氧干預(yù)48h后，低氧組表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白α-SMA表達(dá)較常氧組明顯下降，CollagenⅠ表達(dá)較常氧組明顯升高[18]。參考呂伯東團(tuán)隊(duì)的前期實(shí)驗(yàn)研究成果，本研究將CCSMC置于低氧中培養(yǎng)48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧組α-SMA表達(dá)較常氧組明顯下降，HIF-1α、CollagenⅠ表達(dá)均明顯升高，這說明低氧干預(yù)能使CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，與呂伯東團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果一致。

MAPK信號(hào)通路能調(diào)控細(xì)胞的各種基本生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等。ERK1/2、JNK和p38（α、β、γ和δ）是MAPK家族的成員，與不同類型ED的生理、病理改變有著聯(lián)系[6]。Labazi等[19]在高血壓ED大鼠模型中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以下調(diào)陰莖海綿體中p-ERK1/2水平。Lysiak等[20]通過損傷（完全切斷）和夾損傷（非完全切斷）小鼠陰莖CN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，且伴有p-JNK、p-p38 MAPK水平升高。Abdel等[21]運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)糖尿病型ED大鼠的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38基因表達(dá)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的SD大鼠CCSMC在低氧處理48h后發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)p-ERK表達(dá)無明顯變化，p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)均明顯下降。

綜上所述，低氧誘導(dǎo)CCSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的同時(shí)，伴隨JNK、p38 MAPK信號(hào)的改變，但關(guān)于JNK及p38 MAPK信號(hào)在低氧所致CCSMC表型轉(zhuǎn)化過程中的具體調(diào)控作用尚不清楚。因此，筆者下一步將以p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)下調(diào)與低氧所致CCSMC表型轉(zhuǎn)化之間的相關(guān)性展開深入的研究，為臨床上治療神經(jīng)性ED提供新思路。