劉曉潔，李小雙，張 燕，梁玉青，周 平，趙津藝，張道遠(yuǎn)

(1.中國科學(xué)院 干旱區(qū)生物地理與生物資源重點實驗室，新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.利物浦大學(xué)，英國利物浦 L69 3BX)

蘋果樹腐爛病是由蘋果黑腐皮殼(Valsamali)引起的枝干皮層腐爛的、嚴(yán)重危害蘋果樹的一種病害[1]，該病在世界范圍內(nèi)發(fā)生，病菌屬于子囊菌門，黑腐皮殼科，黑腐皮殼屬[2-3]。新疆野蘋果(Malussieversii,又名塞威士蘋果)，分布于天山山脈，包括中國新疆伊犁地區(qū)和中亞5國。在中國，新疆野蘋果集中分布于新疆伊犁的鞏留、新源、霍城及裕民等地[4]。在中亞，新疆野蘋果分布在哈薩克斯坦、吉爾吉斯坦、烏茲別克斯坦、塔吉克斯坦和土庫曼共和國[5]。新疆野蘋果種質(zhì)資源豐富，具有很高的遺傳多樣性[6]，研究證明新疆野蘋果是現(xiàn)代栽培蘋果(Malusdomestica)的祖先[7]，具有很重要的科研和保護價值。然而，近10 a來，由于多種原因，新疆野蘋果林遭受了毀滅性的生態(tài)危害，大面積的野蘋果純林衰敗甚至死亡，腐爛病的爆發(fā)成為野蘋果林大面積死亡的重要原因之一[8]。經(jīng)過野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，野蘋果腐爛病抗性表現(xiàn)不同，有些植株易感，有些植株則抗性強。因此，從自然種群中快速篩選鑒定強抗腐爛病植株并進行研究及應(yīng)用是一項重要任務(wù)。

目前，蘋果腐爛病鑒定方法主要是烙鐵燙傷樹枝接菌法和針刺葉片接菌法，烙鐵燙傷和針刺方法會對植物造成大小不均一傷口，因個人操作原因重復(fù)之間不能保證傷口一致性，從而導(dǎo)致較大誤差，且過程操作繁瑣，更不便于在野外大規(guī)模操作。因此，需要研制一種簡便易行、準(zhǔn)確高效的、尤其適用于野外大樣本量的新疆野蘋果腐爛病抗性株快速篩選鑒定方法。

本研究構(gòu)建了一套腐爛病病原菌培養(yǎng)-野外接菌-抗性株鑒定的技術(shù)方法，對新疆野蘋果離體枝條和葉片進行接菌鑒定，并對此方法進行了評價。

1 材料與方法

1.1 病原菌材料與培養(yǎng)

蘋果腐爛病(Valsamali)強致病性03-8菌株[9]，由西北農(nóng)林科技大學(xué)黃麗麗教授惠贈。用打孔器(直徑5 mm)菌落邊緣打孔，取菌餅長有菌絲一面接于PDA平板中心，25 ℃暗培養(yǎng)3 d待用。

1.2 植物材料

1.2.1 室內(nèi)植物材料 從新疆野蘋果自然分布區(qū)新疆伊犁新源縣改良場苗圃基地(N43°23′2.20″,E83°35′43.48″)隨機選擇生長健康和狀態(tài)較一致的3 a生新疆野蘋果幼苗，攜土帶回實驗室種植于花盆中，備用；哈薩克斯坦吐爾根地區(qū)(N43°22.138′,E77°40.300′)，奇姆肯特地區(qū)(N42°40.946′,E70°14.795′)野蘋果林采集野蘋果葉片，保濕處理帶回實驗室。

1.2.2 田間植物材料 從新疆野蘋果自然分布區(qū)新疆伊犁新源縣改良場苗圃基地(N43°23′2.20′′,E83°35′43.48′′)隨機選擇生長健康且狀態(tài)較一致的3 a生新疆野蘋果幼苗50株，并從每株幼苗上選取完全展開、大小均一的葉片各5片，連葉柄處剪下，在原地進行腐爛病接菌及抗性鑒定試驗。

1.3 室內(nèi)腐爛病接菌

1.3.1 枝條接菌方式的確定 采用劃布輪(直徑2 cm)進行新疆野蘋果離體材料的刺傷。選取健康的新疆野蘋果枝條，截成15 cm長的小段，水沖洗干凈表皮后用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精浸泡10 min，然后用無菌水沖洗、晾干，枝條兩端用石蠟封口待用；用浸泡70%酒精的脫脂棉球擦拭消毒劃布輪，待酒精晾干用劃布輪刺傷樹皮，刺傷長度至2 cm，備用。

離體枝條接菌試驗采用劉開啟等[10]的方法，用打孔器在已培養(yǎng)好的腐爛病菌株03-8菌落邊緣打孔，取菌餅長有菌絲一面貼合在燙傷部位，以滅菌的PDA固體培養(yǎng)基作為對照，在接菌上方0.5 cm處覆一塊滅菌ddH2O(800 μL)浸濕的脫脂棉，緊密地包裹枝條刺傷部位，使菌餅充分與傷口結(jié)合，再用封口膜將其同時包扎，切勿移動菌餅位置以防菌餅脫離刺傷傷口；將濾紙浸濕鋪平托盤，再將已接好菌的樹枝平放置托盤，用保鮮膜覆蓋好托盤，放置25 ℃培養(yǎng)8 d。

1.3.2 室內(nèi)葉片接菌 選取完全展開、大小均一的新疆野蘋果葉片，連葉柄處剪下，用ddH2O將葉片洗凈，70%的酒精棉球擦拭消毒葉片表面，再用已滅菌ddH2O沖洗干凈葉片表面并晾干，用已消毒的劃布輪沿葉片主葉脈方向滑動刺傷葉片，刺傷傷口約2 cm(遠(yuǎn)離主葉脈)，待用。

室內(nèi)離體葉片接菌試驗采用Wei等[11]的方法，在培養(yǎng)皿中平鋪濾紙，加入已滅菌ddH2O使濾紙完全浸濕，再棄去多余水，放入葉片；長有菌絲面的菌餅貼合在刺將傷傷口處，以滅菌的PDA固體培養(yǎng)基作為對照，蓋好培養(yǎng)皿，用封口膜封住培養(yǎng)皿以便保濕，25 ℃培養(yǎng)4 d。

1.4 田間腐爛病接菌

1.4.1 田間葉片接菌 在新疆伊犁新源縣改良場苗圃基地，選取采下的葉片(共50株，每株5片葉片)在室外直接進行劃布輪刺傷接菌試驗，方法同“1.3.2”室內(nèi)葉片接菌方法，將托盤帶回室內(nèi)，25 ℃保濕培養(yǎng)4 d。

1.5 新疆野蘋果腐爛病抗性評價方法

1.5.1 枝條發(fā)病率、平均病斑長度和嚴(yán)重度 枝條接菌處理后第8天，記錄枝條發(fā)病個數(shù)，用游標(biāo)卡尺測量發(fā)病枝條病斑長度，根據(jù)記錄的發(fā)病枝條個數(shù)和枝條病斑長度，可計算出枝條發(fā)病率，平均病斑長度，即嚴(yán)重度[12-13]。

發(fā)病率=每處理發(fā)病孔數(shù)/接種數(shù)×100%

平均病斑長度=∑發(fā)病孔病斑長度/發(fā)病孔數(shù)

1.5.2 葉片病斑面積和葉面積 葉片接菌處理第4天，參考Stewart等[14]和Abramoff等[15]的方法，拍照并用軟件Image J(Rasband,W.S.,Image J; U. S. National Institutes of Health,http://imagej.nih.gov/ij/,1997-2012)分析測量葉片病斑面積(mm2)和葉片面積(mm2)，根據(jù)記錄可計算出葉片病斑面積比率。

葉片病斑面積比率=病斑面積/對應(yīng)葉片面積×100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS 18.0進行one-way ANOVA數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以植株2的值為參照(表1)，用LSD進行顯著性(P<0.05,P<0.01)分析。根據(jù)劉欣穎等[12]建立的蘋果種質(zhì)資源腐爛病抗病性評價分級標(biāo)準(zhǔn)，將蘋果腐爛病嚴(yán)重度分為5個抗性等級，即發(fā)病率分為：極低Very low(μ≤5%)，低Low(5%<μ≤10%)，較低Moderately low(10%<μ≤25%)，高High(25%<μ≤50%)，極高Very high(μ>50%)；嚴(yán)重度：極輕Very light(M≤10 mm)，輕Light(10 mm70 mm)。發(fā)病率和嚴(yán)重度分別代表植物材料的抗侵入能力和抗擴展能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛病菌接菌方法建立

2.1.1 枝條葉片不同傷害表型 使用電烙鐵燙傷枝條產(chǎn)生褐色燙傷斑(圖1-A)，燙傷面積約 1 cm2，相對于劃布輪刺傷枝條產(chǎn)生的整齊、均一的刺傷傷口(圖1-B)，傷口面積較大且每次燙傷形成的傷口不均一；使用劃布輪刺傷葉片形成的傷口，長度約為1 cm(圖1-D)，相對于使用注射器針頭刺傷葉片10次造成刺傷傷口(圖1-C)，較為整齊，傷口長度一致。

2.1.2 接菌枝條和葉片表型 經(jīng)劃布輪刺傷后，接菌處理的新疆野蘋果枝條和葉片，分別在第8天和第4天出現(xiàn)深褐色水漬狀病斑，如圖2所示，并在傷口處繁殖出大量菌絲體，表明接菌成功。

A.電烙鐵燙傷枝條 Burn of twig by electric soldering iron；B.劃布輪刺傷枝條 Puncture on twig caused by pattern wheel；C.針頭刺傷葉片 Puncture on leaf caused by syringe needle；D.劃布輪刺傷葉片 Puncture on leaf caused by pattern wheel

圖1不同傷害方法在新疆野蘋果枝條葉片的表型
Fig.1DifferentkindsofwoundontwigsandleavesofM.sieversii

A.電烙鐵燙+腐爛病菌03-8 Burn of twig by electric soldering iron+03-8; B. 劃布輪刺傷枝條+腐爛病菌03-8 Puncture on twig caused by pattern wheel+03-8; C. 針頭刺傷葉片腐爛病菌03-8 Puncture on leaf caused by syringe needle+03-8; D. 劃布輪刺傷葉片腐爛病菌03-8 Puncture on leaf caused by pattern wheel+03-8

圖2新疆野蘋果枝條和葉片經(jīng)不同傷害后接菌腐爛病菌03-8發(fā)病表型
Fig.2LesionsoftwigandleafofM.sieversiiinoculatedwithisolate03-8afterdifferentwounds

2.2 新疆野蘋果腐爛病抗性株鑒定方法及評價

2.2.1 不同株枝條抗病性差異 隨機選取5株新疆野蘋果樹，每株選取3根枝條經(jīng)劃布輪刺傷接菌腐爛病菌分離株03-8，對其接菌后第8天的發(fā)病率及平均病斑長度的分析結(jié)果顯示(表1)，這5株新疆野蘋果樹在接菌第8天均發(fā)病，發(fā)病率為100%(極重)；其中植株1的平均病斑長度最長為113.09±5.67 mm，而植株2平均病斑長度最短，為24.56±2.35 mm，其他株平均病斑長度為45～80 mm，說明劃布輪刺傷接菌的方法快速有效；植株2嚴(yán)重度為輕，植株3、4嚴(yán)重度為重，植株1、5嚴(yán)重度為極重。通過對每株發(fā)病率、平均病斑長度和嚴(yán)重度的統(tǒng)計分析，可以顯著區(qū)分不同種質(zhì)資源的抗病性差異。

表1 5株新疆野蘋果離體枝條接菌03-8發(fā)病率和平均病斑長度Table 1 Disease incidence and mean lesion length on excised twigs of 5 M.sieversii trees inoculated with isolate 03-8

注：數(shù)據(jù)為3次平行試驗，LSD分析， “**”表示P<0.01。

Note：The data are LSD analysis of 3 parallel experiments (P<0.01). The asterisk(**) indicates that the significance is less than 0.01.

2.2.2 不同株葉片抗病性差異 隨機選取50株新疆野蘋果樹葉，每株各取5片，葉片經(jīng)劃布輪刺傷后接菌腐爛病分離株03-8，處理第4天形成病斑(圖3-A)，使用SPSS 18.0軟件對其接菌后第4天的葉片相對病斑面積比進行one-way ANOVA方差分析，以植株43的值為參照，進行LSD顯著性(P<0.05,P<0.01)分析，結(jié)果表明劃布輪刺傷接菌葉片平均病斑面積比(圖3)存在差異，其中植株43有最小葉片平均病斑面積比7.20%±2.85%，植株35有最大葉片平均病斑比為87.20%±3.08%，兩植株存在顯著差異。所檢測得50株新疆野蘋果幼苗中，有9株葉片平均病斑面積比小于20%，有5株葉片平均病斑面積比在60%以上，其余介于兩者之間，說明劃布輪刺傷接菌可以使葉片成功發(fā)病，并成功鑒定腐爛病抗性差異植株。

此外，進一步用此方法對哈薩克斯坦野果林隨機采集帶回的葉片進行腐爛病接菌，并于4 d后拍照得到發(fā)病表型(圖4)，結(jié)果顯示不同野蘋果樹具有不同的葉片平均病斑面積比率，表明利用該方法可以初步、快速地鑒定新疆野蘋果腐爛病抗性差異植株。

A．新疆野蘋果離體葉片田間接病斑 Lesions of excised leaves in field ofM.sieversii；B.哈薩克斯坦吐爾根地區(qū)野蘋果離體葉片室內(nèi)接菌病斑 Lesions of laboratory excised leaves in wild apple of Turgen,Kazakhstan；C.哈薩克斯坦奇姆肯特地區(qū)野蘋果離體葉片室內(nèi)接菌病斑 Lesions of laboratory excised leaves in wild apple of Chimkent,Kazakhstan

圖3野蘋果離體葉片接菌腐爛病菌03-8病斑表型
Fig.3LesionsofleavesofM.sieversiiinfieldinoculatedwithisolate03-8

3 討 論

研究腐爛病病害的傳統(tǒng)方法為枝條燙傷傷口接菌法。離體枝條用烙鐵燙傷后接菌餅，是一種較好的致病力鑒定方法，通過此方法已鑒定出不同腐爛病分離株致病力差異[9]。Chang等[16]和Rozsnyay等[17]也曾使用燙傷桃和櫻桃離體枝條鑒定Cytospora的致病性。然而，烙鐵燙傷枝條法也存在許多問題，如燙傷時間、燙傷深淺程度、燙傷面積都不能保持一致，使得燙傷傷口不均一，因個人主觀因素造成誤差。Bessho等[18]發(fā)現(xiàn)，烙鐵燙傷時間長短直接影響接菌病斑大小。這些都會對腐爛病接菌試驗產(chǎn)生誤差，從而進一步影響腐爛病致病機制的研究。

采用LSD方法進行顯著性分析，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01 The data in the figure are LSD analysis(P<0.05,P<0.01). The asterisk(*) indicates that the significance is less than 0.05,asterisk(**) is less than 0.01

圖450株新疆野蘋果離體葉片田間接菌03-8葉片平均病斑面積比
Fig.4TheMeanpercentageofleafareacoveredbylesion(PLACL)onexcisedleavesof50M.sieversiitreesinfieldinoculatedwithisolate03-8

本研究發(fā)現(xiàn)，用劃布輪刺傷枝條和葉片表面接菌餅的方法，25 ℃保濕培養(yǎng)，枝條可在第3天開始發(fā)病，并在第8天統(tǒng)計結(jié)果，發(fā)病率達100%，平均病斑長度為24～114 mm，與臧睿等[9]利用燙傷方法所形成深褐色、水漬狀的病斑一致，但本方法操作更為簡易且可重復(fù)性強，并且通過統(tǒng)計枝條病斑嚴(yán)重度，可以顯著區(qū)分不同種質(zhì)資源的抗病性差異。葉片可在第2天開始發(fā)病，第4天測算葉片平均病斑比率，分布在7%～88%之間，經(jīng)過顯著性分析，可鑒定出50株新疆野蘋果腐爛病抗病性差異。完全展開葉片材料本身均一性較好，誤差小，鑒定結(jié)果穩(wěn)定，適宜作為接種材料的致病力鑒定體系，這與Wei等[11]觀點相一致。本研究使用劃布輪為刺傷工具，刺傷枝條和葉片，這種接菌方式主要有以下優(yōu)點：(1)劃布輪小巧輕便，操作簡單，適用于實驗室和田間試驗；(2)快速高效接菌，形成的刺傷傷口大小均一，傷口長度可控，減少誤差；(3)對植株造成的傷害程度低，使試驗結(jié)果更準(zhǔn)確。

該方法發(fā)病時間短且發(fā)病穩(wěn)可信，能準(zhǔn)確穩(wěn)定地建立腐爛病-蘋果病癥模型，鑒定腐爛病菌株致病力以及蘋果腐爛病抗性株篩選。因此可用于腐爛病機制研究和種質(zhì)腐爛病抗病性初級篩選，為新疆野蘋果林保護與生態(tài)恢復(fù)提供技術(shù)支撐。