張學(xué)燕，聶召龍，王 通，潘 浩，孫 璐，王 磊，劉書杰，崔占鴻

(青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

犢牛腹瀉病是青藏高原牦牛養(yǎng)殖中的常見疾病，嚴(yán)重影響犢牛的早期培育質(zhì)量，主要是腸道病原菌和(或)病毒混合感染引起腸道正常菌群結(jié)構(gòu)失衡所致。牦犢牛腹瀉最早發(fā)生在剛出生時(shí)期，發(fā)病期主要在2～5月齡，腹瀉率為17.57%，致死率為44.91%[1]。高睿等[2]研究表明，引起犢牛腹瀉的細(xì)菌性病原主要是致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等；同時(shí)，病原菌沙門氏菌和大腸桿菌的耐藥性表現(xiàn)也比較嚴(yán)重[3-4]。益生菌是一種能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系平衡，有利于動(dòng)物健康發(fā)育和提高生產(chǎn)性能的微生物制劑，主要表現(xiàn)為提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及利用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抵抗力，促進(jìn)動(dòng)物胃腸道生長(zhǎng)發(fā)育[5-6]。乳酸菌作為一種重要的益生菌，在動(dòng)物腸道定植生長(zhǎng)良好，能產(chǎn)生大量有機(jī)酸類物質(zhì)，可在腸道中形成一層菌膜，有效抵抗病毒和病原微生物的侵襲，增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗力[7]。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制作用[8]，且能有效抑制大腸桿菌[9]和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[10]。但由于動(dòng)物種類和生長(zhǎng)環(huán)境的差異，益生乳酸菌定植于動(dòng)物胃腸道的細(xì)菌種類和數(shù)量會(huì)有較大差異，且來自同源動(dòng)物的菌種更有利于在動(dòng)物體內(nèi)定植。因此，因地制宜地分離篩選出牦犢牛源益生乳酸菌，對(duì)其腹瀉病預(yù)防和抗生素治療藥物替代研究非常重要，也具有很好的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌源樣品及培養(yǎng)基

菌源樣品來自青海省大通種牛場(chǎng)健康的3月齡牦犢牛6頭，屠宰后取胃腸道內(nèi)容物洋浦冷藏保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離試驗(yàn)；指示菌株選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，由青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[11]配制；MH肉湯培養(yǎng)基配制：2 g牛肉粉，1.5 g可溶性淀粉，17.5 g酸水解酪蛋白，用去離子水定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 抑病原菌乳酸菌的分離及純化

菌株分離純化：參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行；菌株保存：用滅菌的白色槍頭蘸取純菌株菌落，接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，加甘油在-80 ℃下保存。

1.3 抗病原菌乳酸菌的篩選

①配制含瓊脂的液體MH肉湯培養(yǎng)基；② 1×105Pa滅菌20 min；③冷卻至50 ℃左右；④每20 mL MH肉湯培養(yǎng)基中加入新培養(yǎng)的指示菌20 μL(108CFU/mL)，混勻后倒入培養(yǎng)皿中冷卻；⑤用滅菌鑷子將牛津杯放入冷卻的固體MH肉湯培養(yǎng)皿中；⑥分別吸取200 μL純菌株培養(yǎng)液和MRS液體培養(yǎng)基加入到牛津杯，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)；⑦4 ℃冰箱放置固定30 min；⑧37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，篩選出能夠同時(shí)抑制3種指示病原菌的乳酸菌菌株，編號(hào)為XC3、DC8、DC1和A5。

1.4 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的純菌株2 mL；②常溫下，4 000 r/min離心10 min，獲得菌體；③用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[Bacterial DNA Kit(50)D3350-01]提取細(xì)菌總DNA；④以1 μL純化的細(xì)菌總DNA為模板，用16S rRNA基因通用引物對(duì)菌株16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.5 乳酸菌的 16S rRNA基因序列分析

根據(jù)16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果，登錄NCBI網(wǎng)站，使用BLAST對(duì)比進(jìn)行菌種的初步確定。結(jié)合GenBank中乳酸菌屬中其他菌種的16S rRNA基因序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線及pH變化

將篩選的乳酸菌菌株培養(yǎng)液按φ=1%接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，從0 h開始每間隔2 h取出3個(gè)離心管(3個(gè)平行)，24 h后分別于30 h、36 h、48 h各取3個(gè)離心管，測(cè)定每管OD600nm的吸光光度值和pH。

1.7 乳酸菌的耐酸及耐膽鹽特性測(cè)定

用1 mol/L鹽酸對(duì)液體MRS培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整，使pH分別為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.4。在不同 pH的液體MRS培養(yǎng)基中按φ= 1%接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)OD600nm值。

在液體 MRS培養(yǎng)基中加入牛膽鹽，制成膽鹽質(zhì)量濃度分別為0(對(duì)照)、1.5、3和6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基。在不同膽鹽質(zhì)量濃度的液體MRS培養(yǎng)基中按10 μL/mL接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取100 μL進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

菌株存活率=a1/a0×100%；a1：處理組24 h 后每毫升活菌數(shù)(CFU/ mL)，a0：對(duì)照組24 h 后每毫升活菌數(shù)(CFU/ mL)。

1.8 乳酸菌人工胃腸液耐受性測(cè)定

配制A液：16.4 mLφ=9.5%～10.5%的HCl用蒸餾水稀釋至pH為3.0；配制B液：500 mL蒸餾水中加入6.8 g KH2PO4，溶解后用4 g/L 的NaOH溶液調(diào)pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL。配制人工胃液：100 mL A溶液中加入1.0 g胃蛋白酶，充分溶解并混勻后用0.2 μm無菌濾膜過濾。配制人工腸液：用100 mL B液體中加入1.0 g胰蛋白酶，充分溶解并混勻后用0.2 μm無菌濾膜過濾。在人工胃液和腸液中按10 μL/mL接入乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的培養(yǎng)液，37 ℃ 140 r/min搖床培養(yǎng)，分別在0、0.5和3 h取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)先采用Excel 2016進(jìn)行初步分析，再用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑病原菌乳酸菌的分離篩選

在相同濃度指示菌條件下，從牦犢牛胃腸道內(nèi)容物中共篩選出XC3、DC8、DC1和A5 4株同時(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌具有良好抑制作用的菌株(圖1)。

2.2 乳酸菌的 16S rRNA基因序列分析

通過對(duì)菌株XC3、DC8、DC1和A5的16S rRNA基因測(cè)序，對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株XC3與乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain L169(登錄號(hào)：GU904688.1))相似性為100%；菌株DC8與羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteristrain VB4(登錄號(hào)：JQ073738.1))相似性為99%；菌株DC1與戊糖片球菌(P.pentosaceusstrain F1S2(登錄號(hào)：KF245540.1))相似性為100%；菌株A5與植物乳桿菌(L.plantarumstrain KC28(登錄號(hào)：CP026743.1))相似性為100%。將菌株XC3、DC8、DC1和A5的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中部分乳酸菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，應(yīng)用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，菌株XC3與乳酸片球菌(P.acidilactici)親緣關(guān)系最近，其次是棒狀皮炎球菌(P.lolii)；菌株DC8與羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)親緣關(guān)系最近；菌株DC1與戊糖片球菌(P.pentosaceus)親緣關(guān)系最近；菌株A5與乳桿菌(L.plantarumL. brevis)親緣關(guān)系最近。初步確定菌株XC3為乳酸片球菌，DC8為羅伊氏乳桿菌，DC1為戊糖片球菌，A5為植物乳桿菌。

圖1 乳酸菌的抑菌圈直徑Fig.1 Determination of bacteriostasis circle diameter of lactic acid bacteria

圖2 依據(jù) 16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees based on 16S rRNA gene sequences

2.3 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線及pH變化

在一定范圍內(nèi)，菌株懸浮液中細(xì)胞濃度與吸光度呈正相關(guān)，因此，一定波長(zhǎng)下菌株懸浮液的濃度可用光密度反應(yīng)。從菌種生長(zhǎng)曲線圖可以看出(圖3)，4株乳酸菌的延遲期比較短，在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，乳酸菌DC1、DC8和A5培養(yǎng)6 h后，生長(zhǎng)速率下降，乳酸菌XC3培養(yǎng)8 h后，生長(zhǎng)速率下降，但是菌株依舊生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)12 h后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)48 h后菌株未進(jìn)入衰退期。菌株生長(zhǎng)速率與菌株培養(yǎng)液的pH變化規(guī)律相一致(圖4)，即乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在2～12 h快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH迅速下降，12 h后pH基本穩(wěn)定。

2.4 4株乳酸菌的耐酸和耐膽鹽特性

從圖5可以看出，隨著pH的下降，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的活菌數(shù)均不同程度降低，pH=3時(shí)，4株乳酸菌的活菌數(shù)較高；pH=2時(shí)，4株乳酸菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，活菌數(shù)明顯下降，說明4株乳酸菌對(duì)pH=2的酸性環(huán)境表現(xiàn)出高度敏感。

由表1可以看出，牛膽鹽對(duì)乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的生長(zhǎng)有抑制作用。隨著膽鹽質(zhì)量濃度的增加，對(duì)4株乳酸菌的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。牛膽鹽質(zhì)量濃度對(duì)不同乳酸菌菌株的生長(zhǎng)具有不同的抑制作用。乳酸菌菌株在1.5 g/L的牛膽鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，菌株XC3的耐受性最強(qiáng)，存活率達(dá)到98.46%，菌株DC8、A5和DC1的存活率分別為87.30%、86.72%和51.88%；乳酸菌菌株在3 g/L的牛膽鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，菌株XC3的存活率為93.85%，菌株DC8和A5的存活率降為51.59%和51.18%，菌株DC1受到較強(qiáng)抑制作用，存活率僅為6.77%；培養(yǎng)液中膽鹽質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，4株乳酸菌菌株的生長(zhǎng)均受到極強(qiáng)抑制，存活率均低于10%。

圖3 4株乳酸菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 The growth curve of four lactic acid bacteria

圖4 4株篩選乳酸菌培養(yǎng)液的pH變化Fig.4 Changes of pH in culture medium of four lactic acid bacteria

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercase letters represent significant difference(P<0.05)

表1 4株乳酸菌在不同膽鹽質(zhì)量濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)及存活率Table 1 The viable counts of four lactic acid bacteria in bile salt with different mass concentration after 24 h

2.5 乳酸菌對(duì)人工胃液和腸液的耐受性

由表2和表3可以看出，與0 h(對(duì)照組)相比較，4種乳酸菌生長(zhǎng)均受胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制，處理0.5 和3 h后活菌數(shù)均有所下降。但是4種乳酸菌菌株對(duì)人工胃液、腸液有一定的耐受性，人工胃液處理0.5 和3 h后，4株乳酸菌的存活率均高于80%，經(jīng)人工腸液處理0.5 和3 h，存活率均高于70%。

表2 人工胃液處理下4株乳酸菌的活菌數(shù)及存活率Table 2 Effect of artificial gastric juice on survivability and survival rate of four lactic acid bacteria

表3 人工腸液處理下4株乳酸菌的活菌數(shù)及存活率Table 3 Effect of artificial intestinal juice on survivability and survival rate of Lactic acid bacteria

3 討 論

細(xì)菌性腹瀉是新生犢牛的一種常發(fā)性疾病，犢牛一旦感染，生長(zhǎng)發(fā)育受到一定程度的影響，生產(chǎn)性能降低，造成不可忽視的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌是引起動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌[12]。乳酸菌及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的酸性內(nèi)環(huán)境，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng)與繁殖表現(xiàn)出不同程度的抑制作用[13-14]。本研究將篩選菌源定位于同種動(dòng)物(牦犢牛的胃腸道內(nèi)容物)，通過抗病原菌特性篩選出能夠同時(shí)抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的乳酸菌，從而得到適合應(yīng)用于牦犢牛生產(chǎn)的微生物添加劑菌種。通過16S rRNA基因序列分析與鑒定表明菌株XC3為乳酸片球菌，菌株DC8為羅伊氏乳桿菌，菌株DC1為戊糖片球菌，菌株A5為植物乳桿菌。

微生物在生長(zhǎng)過程中，總共經(jīng)歷4個(gè)時(shí)間段，分別為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線對(duì)于確定合適的培養(yǎng)時(shí)間具有重要作用，常將微生物對(duì)數(shù)中后期和穩(wěn)定期的菌液作為微生物制劑研究對(duì)象。本研究中觀察乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，4株乳酸菌在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后進(jìn)入穩(wěn)定時(shí)期，細(xì)菌數(shù)較高，穩(wěn)定性較好，是生產(chǎn)上用于接種的最適合菌齡。發(fā)酵液 pH可直觀地反映菌株的產(chǎn)酸能力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5培養(yǎng)液的pH均不同程度下降，培養(yǎng)12 h后菌液的pH下降速度減慢，基本趨于穩(wěn)定狀態(tài)，適合應(yīng)用于微生物制劑的制備。

目前已有關(guān)于體外法篩選益生菌的相關(guān)報(bào)道[15]。益生菌對(duì)瘤胃和腸道內(nèi)環(huán)境的較高耐受性是篩選優(yōu)良益生菌的重要指標(biāo)之一[16-17]。乳酸菌pH和膽鹽質(zhì)量濃度的耐受性提高了乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物腸道的定植能力[18]。酸耐受性是檢測(cè)乳酸菌益生作用的重要指標(biāo)，乳酸菌只有耐受胃液的低pH環(huán)境，才可能在胃腸道環(huán)境中定植，發(fā)揮其益生功能[19]。本研究結(jié)果表明，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在pH=2的環(huán)境中受到嚴(yán)重影響，活菌數(shù)迅速降低，在pH=3的環(huán)境，菌株的活菌數(shù)較高，說明乳酸菌對(duì)低酸的胃內(nèi)環(huán)境有抵御力。膽鹽耐受性是檢測(cè)乳酸菌能否在胃腸道定植，并在腸道發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵指標(biāo)[20]。膽鹽會(huì)使膜蛋白解離，細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。乳酸菌需要耐受3 g/L膽鹽的腸道內(nèi)環(huán)境才能在腸道中定植[22]。本研究中，膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，乳酸菌XC3生長(zhǎng)狀況良好，乳酸菌DC8和A5的生長(zhǎng)受到一定影響，但存活率在50% 以上，說明乳酸菌 XC3、DC8和A5能夠耐受腸道內(nèi)膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境。乳酸菌DC1在膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L的環(huán)境中生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，存活率僅有6.77%，說明乳酸菌DC1對(duì)腸道內(nèi)的膽鹽環(huán)境抵御力弱。

胃液中的胃蛋白酶等抗菌物質(zhì)是抵御乳酸菌進(jìn)入腸道的第一道天然屏障。本研究利用人工胃液檢測(cè)各菌株的生長(zhǎng)情況，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在人工胃液中生長(zhǎng)3 h 存活率均大于80%，由此推測(cè)乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5作為益生菌對(duì)胃內(nèi)酸性環(huán)境具有較強(qiáng)抵抗力，大部分都可以在胃內(nèi)存活。同時(shí)，益生乳酸菌若要在動(dòng)物腸道存活及增殖，需要能夠耐受膽鹽和胰液對(duì)菌體的破壞作用[23]。模擬人工腸液試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5在人工腸液中生長(zhǎng)3 h存活率均大于70%，說明乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5作為益生菌對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境有較強(qiáng)抵抗力，能夠在腸道中成功定植并生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

以牦犢牛的胃腸道內(nèi)容物為菌源，分離篩選出對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌3種致病菌具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌XC3、DC8、DC1和A5，經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定，確定XC3為乳酸片球菌，DC8為羅伊乳桿菌，DC1為戊糖片球菌，A5為植物乳桿菌；通過對(duì)篩選乳酸菌的耐酸、耐膽鹽，人工胃液和腸液耐受性等體外益生特性研究，確定XC3、DC1和A5具有潛在的益生作用，能作為牦犢牛益生菌制劑的添加對(duì)象。