戴 結(jié)

中國(guó)人民解放軍海軍安慶醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003

在西方國(guó)家,2%～7%的成年人患有Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)，這是一種有惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的腸型化生黏膜取代胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)損傷的食管鱗狀上皮黏膜[1]。高達(dá)40%的西方成年人存在GERD癥狀，目前尚不清楚為何這些人中只有少數(shù)發(fā)展為BE[2]。研究表明，當(dāng)食管鱗狀上皮細(xì)胞暴露于反流胃液中的有毒物質(zhì)酸和膽鹽時(shí)，個(gè)體之間在激活的分子通路上存在差異，這些差異可能決定了GERD 損傷的食管是通過(guò)鱗狀細(xì)胞再生還是通過(guò)伴隨 BE發(fā)展的化生而愈合[3-4]。

流行病學(xué)研究表明，使用阿司匹林和其他非甾體抗炎藥(NSAIDs)可以預(yù)防由 Barrett 化生發(fā)展而來(lái)的食管腺癌[5]。最近的一項(xiàng)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以防止Barrett化生在具有GERD癥狀的個(gè)體中發(fā)生，而其他NSAIDs則無(wú)這種作用[6]。與其他NSAIDs不同的是，阿司匹林除抑制從花生四烯酸中產(chǎn)生前列腺素的環(huán)氧合酶外，還抑制促炎性NF-κB通路[7]。因此，推測(cè)阿司匹林對(duì)Barrett化生發(fā)展的獨(dú)特保護(hù)作用可能歸因于其對(duì)NF-κB的抑制作用。

NF-κB在正常食管鱗狀上皮中不激活，但在GERD炎癥形成的食管上皮中被激活[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽在食管鱗狀細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB通路信號(hào)傳導(dǎo)[9]。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)是一個(gè)受NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)影響的決定腸上皮細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[10]。CDX2啟動(dòng)子包含兩個(gè)推測(cè)的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)[11]。大量研究表明，酸和膽鹽可以增加CDX2啟動(dòng)子的活性，并增加大鼠和部分人食管鱗狀細(xì)胞中CDX2 mRNA 的表達(dá)[12-13]。在反流性食管炎的動(dòng)物模型中，反流損傷的食管上皮在出現(xiàn)Barrett化生之前也表現(xiàn)出CDX2表達(dá)增加[14]。這表明發(fā)炎的食管鱗狀上皮中CDX2的表達(dá)可能預(yù)示著B(niǎo)E的發(fā)展，而CDX2的表達(dá)可能是NF-κB通路信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)果。

本研究主要探討酸和膽鹽在BE患者的食管鱗狀細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB活化和CDX2表達(dá)的機(jī)制，以及阿司匹林能否抑制這種表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑我們使用了2種非腫瘤性端粒酶永生化食管鱗狀細(xì)胞(NES)系：NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞，分別由合并BE的GERD患者(NES-B)和無(wú)合并BE的GERD患者(NES-G)遠(yuǎn)端食管鱗狀上皮內(nèi)鏡活檢標(biāo)本制成[15]，均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；阿司匹林(含量98%)、鹽酸、結(jié)合膽汁酸等購(gòu)自上海撫生生物科技有限公司； CDX2、GAPDH、NF-κB/p50、p65、p-p65、IκB、p-IκB、PKAc等抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兩步法RT-PCR試劑盒、引物、Western blotting檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光液等購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞均生長(zhǎng)于含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.3 酸和膽鹽暴露將細(xì)胞暴露于3種不同的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：(1)酸性完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(用1 mol/L HCl使pH值達(dá)到4.0)；(2)中性膽鹽培養(yǎng)基(含有總濃度為400 μmol/L的結(jié)合膽汁酸，pH值為7.2)；(3)酸性膽鹽培養(yǎng)基(同一膽汁酸溶液，pH值為4.0)。中性完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(pH值為7.2)作為對(duì)照培養(yǎng)基。 在24 h的暴露中，將酸性完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基和酸性膽鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為5.5。

1.4 阿司匹林干預(yù)在Western blotting實(shí)驗(yàn)中，用100 μmol/L的阿司匹林預(yù)處理細(xì)胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和膽鹽培養(yǎng)基30 min，然后收集細(xì)胞裂解物。在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，用100 μmol/L的阿司匹林預(yù)處理細(xì)胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和膽鹽培養(yǎng)基24 h， 然后收集總RNA。在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，加入含有阿司匹林的酸性和膽鹽培養(yǎng)基60 min，然后去除并置換中性 pH 培養(yǎng)基6 h。然后測(cè)定細(xì)胞提取物的熒光素酶活性。對(duì)照組為中性完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(pH值為7.2)，加或不加阿司匹林。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)用胰酶消化收集細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。水浴法蛋白變性后，加入蛋白上樣緩沖液，采用質(zhì)量濃度為100 g/L聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗按1∶1 000稀釋，4 ℃下孵育過(guò)夜，二抗在室溫下孵育2 h，使用ECL顯影液發(fā)光顯影。

1.6 染色質(zhì)免疫沉淀法檢測(cè)取提取的組織蛋白樣品500 μg，加入抗p65或p50抗體10 μl，4 ℃輕搖2 h，加入20 μl蛋白A-瓊脂糖，4 ℃輕搖過(guò)夜。4 ℃ 1 000×g離心，棄上清。1 ml PBS懸浮沉淀，4 ℃ 1 000×g離心5 min，洗滌沉淀。重復(fù)3次。4 ℃ 1 000×g離心，棄上清，留沉淀。上樣緩沖液加入沉淀，煮沸5 min，離心后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，含5%(W/V)卵清蛋白的 TTBS緩沖液封閉，室溫輕搖1 h，加入抗CDX2抗體，用TBS 緩沖液稀釋抗CDX2抗體(1∶500)，將膜和適量的抗體稀釋液放入雜交袋，4 ℃輕搖過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，與膜室溫孵育1 h，用ECL增強(qiáng)發(fā)光顯影。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品準(zhǔn)備質(zhì)粒-Lipo 2000混合液。 將質(zhì)粒-Lipo 2000混合液加入含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的48孔板中搖勻，置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，移去培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)到48 h測(cè)熒光素酶活性。取5 μl細(xì)胞裂解液與螢火蟲(chóng)熒光素酶緩沖液及底物5 μl(按Promega雙熒光報(bào)告系統(tǒng)測(cè)量試劑盒說(shuō)明)混勻測(cè)量熒光強(qiáng)度，然后加入海腎熒光素酶反應(yīng)緩沖液及腔腸素底物5 μl，混勻再次測(cè)得海腎熒光素酶活性。將每個(gè)樣品按照海腎熒光素酶活性進(jìn)行均一化處理，比較螢火蟲(chóng)熒光素酶活性并繪制圖表。

1.8 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p65蛋白的核轉(zhuǎn)位滴加以0.01 mol/L，pH值為7.4的PBS稀釋的特異性p65熒光抗體標(biāo)本，覆蓋p65抗原標(biāo)本片，玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)37 ℃保溫30 min。先用PBS沖洗2次，然后按順序過(guò)PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時(shí)振蕩，取出玻片，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)37 ℃保溫30 min，再重復(fù)上述操作1次，取出玻片，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.9 qRT-PCR法檢測(cè)CDX2 mRNA的表達(dá)采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增操作，以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)細(xì)胞中CDX2 mRNA的表達(dá)量。引物序列：CDX2 上游5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

2 結(jié)果

2.1 酸和膽鹽暴露后NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞中NF-κB亞基p50和 p65的核移位比較與未經(jīng)處理的對(duì)照組比較，NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞具有相似水平的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核p65和p50蛋白。用酸、膽鹽或兩者聯(lián)合處理NES-B細(xì)胞，可以消除p65和p50的胞漿水平，并導(dǎo)致細(xì)胞核中p50和p65的水平顯著升高。與此相反，用酸和膽鹽處理NES-G細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中p50和p65的水平降低而不消除，并導(dǎo)致細(xì)胞核中p50水平升高，而p65水平僅略微升高(見(jiàn)圖1)。

注：A：?jiǎn)渭兯峤M; B：?jiǎn)渭兡扄}組; A&B: 酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。

圖1 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-B和NES-G細(xì)胞中胞質(zhì)和胞核p65和p50蛋白的表達(dá)水平變化

Fig 1 Changes of cytoplasmic and nucleus p65 and p50 protein expression levels in NES-B and NES-G cells after exposureto acid, bile salts and acidic bile salts

在本研究中使用NES-G細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的NES-G細(xì)胞中p50和p65與CDX2啟動(dòng)子DNA的結(jié)合程度最低，雖然酸和膽鹽暴露引起NES-G細(xì)胞中p50的核轉(zhuǎn)位，但核轉(zhuǎn)位并不伴隨p50與CDX2啟動(dòng)子的結(jié)合增加(見(jiàn)圖2)。

2.2 酸和膽鹽對(duì)NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞中p50/p65異二聚體形成及與IκB和PKAc結(jié)合的p65量的影響對(duì)p50進(jìn)行免疫沉淀，然后對(duì)p65進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，以證實(shí)NF-κB蛋白在NES-G和NES-B細(xì)胞系中形成異二聚體。結(jié)果顯示，未受刺激的兩種細(xì)胞均表現(xiàn)出p50/p65異二聚體形成。暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽后，NES-G細(xì)胞中的異二聚體形成量增加不明顯，而NES-B細(xì)胞中的異二聚體形成量輕微增加(見(jiàn)圖3)。對(duì)p65進(jìn)行免疫沉淀法測(cè)定，然后對(duì)IκB進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡測(cè)定，以確定細(xì)胞質(zhì)中與IκB結(jié)合的p65的量。結(jié)果顯示，在NES-G細(xì)胞中，暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽僅導(dǎo)致與IκB結(jié)合的p65極小量降低。 同樣的暴露使NES-B細(xì)胞中仍與IκB結(jié)合的p65量明顯減少。通過(guò)對(duì)p65蛋白的免疫沉淀法分析，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A (PKAc) 確實(shí)是NES 細(xì)胞中IκB-NF-κB復(fù)合物的一個(gè)組成部分。在NES-G細(xì)胞中，暴露于酸和膽鹽僅引起PKAc結(jié)合的p65的最小量變化。在NES-B細(xì)胞中，暴露于酸和膽鹽的結(jié)合，實(shí)際上消除了PKAc與p65的結(jié)合(見(jiàn)圖4)。

注：A：?jiǎn)渭兯峤M; B：?jiǎn)渭兡扄}組; A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。

注：IP為免疫沉淀法; IB為免疫印跡法。A：?jiǎn)渭兯峤M; B：?jiǎn)渭兡扄}組; A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。圖3 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細(xì)胞質(zhì)中p50/p65異二聚體形成情況Fig 3 Formation of p50/p65 heterodimer in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic bile salts

2.3 酸和膽鹽對(duì)NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性的影響暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽后，NES-B細(xì)胞的 IκB(Ser32/36)和 p65(Ser276)磷酸化水平明顯升高。在NES-G細(xì)胞中這些相同的暴露導(dǎo)致IκB的磷酸化只有較少的增加，而p65的磷酸化僅有極少的增加(見(jiàn)圖5)。利用NF-κB熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體，發(fā)現(xiàn)酸性膽鹽處理能顯著提高NES-B細(xì)胞中NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性，但在NES-G細(xì)胞中無(wú)這種效應(yīng)(見(jiàn)圖6)。

注：IP為免疫沉淀法; IB為免疫印跡法。A：?jiǎn)渭兯峤M; B：?jiǎn)渭兡扄}組; A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。圖4 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細(xì)胞質(zhì)中與IκB和PKAc結(jié)合的p65蛋白水平的變化 Fig 4 Changes of p65 protein bound to IκB and PKAc in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic biles

注：A：?jiǎn)渭兯峤M；B：?jiǎn)渭兡扄}組；A&B：酸及膽鹽組；C：對(duì)照組。

圖5 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細(xì)胞中IκB(Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的變化

Fig 5 Changes of phosphorylation levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) of NES-G and NES-B cells after exposure toacid, bile salts and acidic bile salts

2.4 阿司匹林對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的NES-B細(xì)胞 IκB 磷酸化、 p65核轉(zhuǎn)位、 CDX2啟動(dòng)子活化及CDX2 mRNA表達(dá)的影響用酸性膽鹽和阿司匹林(100 μmol/L)處理NES-B細(xì)胞，并檢測(cè)IκB和p65的磷酸化水平及CDX2啟動(dòng)子活性和mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿司匹林預(yù)處理消除了酸性膽鹽誘導(dǎo)的IκB磷酸化增加，而不消除p65的磷酸化(見(jiàn)圖7)，并阻斷了p65核轉(zhuǎn)位的增加(見(jiàn)圖8)。 阿司匹林消除了NES-B細(xì)胞中酸性膽鹽誘導(dǎo)的CDX2啟動(dòng)子活性的增加(見(jiàn)圖9)和CDX2 mRNA表達(dá)的增加(見(jiàn)圖10)。

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組；與C比較,*P<0.05。

圖6 NES-G和NES-B細(xì)胞在酸性膽鹽暴露后NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性

Fig 6 Transcriptional activity of NF-κB/p65 in NES-G andNES-B cells after acidic bile salts exposure

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。

圖7 阿司匹林對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的NES-B細(xì)胞中IκB (Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的影響

Fig 7 Effect of Aspirin on the levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) phosphorylation in NES-B cells induced by acid and bilesalts

3 討論

Huo等[16]發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽在NES-B細(xì)胞和NES-G細(xì)胞中激活NADPH氧化酶系統(tǒng)以產(chǎn)生H2O2，后者通過(guò)一系列的磷酸化作用激活I(lǐng)κB-NF-κB-PKAc復(fù)合物。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在NES-B細(xì)胞中IκB和p65的磷酸化水平遠(yuǎn)高于暴露于相同濃度酸和膽鹽的NES-G細(xì)胞中的水平。由于NES-G細(xì)胞中IκB-NF-κB-PKAc復(fù)合物的有限激活，NF-κB亞基p65在細(xì)胞質(zhì)中仍與IκB結(jié)合，與亞基p50不同，p65不會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，這一點(diǎn)很關(guān)鍵，因?yàn)榧词怪挥衟50與CDX2啟動(dòng)子相結(jié)合，但核p65蛋白水平的增加是CDX2啟動(dòng)子被酸和膽鹽激活所必需的[16]。最后，我們證明了阿司匹林可以阻止IKKβ激活 IκB，阻斷酸和膽鹽誘導(dǎo)的NES-B細(xì)胞IκB的磷酸化、p65的核轉(zhuǎn)位、CDX2啟動(dòng)子的激活和CDX2 mRNA的表達(dá)。

注：DAPI顯示同一區(qū)域的細(xì)胞核數(shù)目(比例尺=50 μm)。A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。

圖8 免疫熒光技術(shù)觀察阿司匹林對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的NES-B細(xì)胞中p65蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

Fig 8 The effect of Aspirin on acidic bile salts-induced nucle-ar translocation of p65 protein in NES-B cells observed by im-munofluorescence technology

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組;與C比較,*P<0.05。

Fig 9 Effect of Aspirin on activation of CDX2 promoter inNES-B cells induced by acidic bile salts

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對(duì)照組。

圖10 阿司匹林對(duì)酸和膽鹽誘導(dǎo)的NES-B細(xì)胞中CDX2 mRNA表達(dá)的影響

Fig 10 Effect of Aspirin on expression of CDX2 mRNA in NES-B cells induced by acidic bile salts

本研究已經(jīng)闡明了合并與不合并BE的GERD患者食管細(xì)胞在酸和膽鹽激活 IκB-NF-κB-PKAc復(fù)合物程度之間的主要差異。這些差異可以解釋為什么酸和膽鹽能誘導(dǎo)NES-B細(xì)胞而不誘導(dǎo)NES-G細(xì)胞中CDX2的表達(dá)。CDX2是腸型柱狀上皮形成所需的關(guān)鍵同源異型基因，CDX2在食管鱗狀細(xì)胞中的表達(dá)預(yù)示著腸化的發(fā)生。因此，GERD患者在反流引起食管IκB-NF-κB-PKAc復(fù)合物激活(NF-κB信號(hào)導(dǎo)致CDX2的表達(dá))程度上的差異可能決定了其是否導(dǎo)致Barrett腸型化生的發(fā)展。

NF-κB活性可由多種信號(hào)觸發(fā)，所有這些信號(hào)最終都會(huì)匯聚到一個(gè)共同的靶點(diǎn)—細(xì)胞質(zhì)IκB-NF-κB-PKAc復(fù)合物上。復(fù)合物中IκB蛋白的磷酸化導(dǎo)致其降解，同時(shí)釋放 PKAc和NF-κB亞基p65。觸發(fā)IκB降解的信號(hào)也可激活PKAc，導(dǎo)致p65(Ser276)磷酸化，這是一種有利于p50/p65異二聚體形成和刺激p65轉(zhuǎn)錄活性的翻譯后修飾。此外，在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，PKAc的激活強(qiáng)度已被證明與p65結(jié)合的PKAc的丟失相關(guān)[17]。使用免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法，我們發(fā)現(xiàn)，PKAc確實(shí)與IκB和p65共存于食管鱗狀細(xì)胞的復(fù)合物中。我們還發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽使NES-B細(xì)胞而非NES-G細(xì)胞中結(jié)合在IκB和PKAc上的p65明顯減少，伴隨著p50/p65異二聚體形成的輕微增加和NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄活性的顯著增加。

NSAIDs、Barrett化生和Barrett癌癥之間的關(guān)系仍是一個(gè)極具爭(zhēng)議的話題，不同的研究有時(shí)會(huì)得出相互矛盾的結(jié)論。例如，最近的一項(xiàng)使用Meta分析方法對(duì)病例對(duì)照研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NSAIDs(包括阿司匹林)的使用和BE的存在無(wú)相關(guān)性[18]。與其他NSAIDs不同，阿司匹林阻斷ATP與IKK-β的結(jié)合，從而使其磷酸化IκB的主要功能喪失[19]。我們發(fā)現(xiàn)，濃度為100 μmol/L的阿司匹林消除了NES-B細(xì)胞中酸和膽鹽誘導(dǎo)的IκB磷酸化、 CDX2啟動(dòng)子活化和 CDX2 mRNA 表達(dá)的增加。阿司匹林對(duì) p65的磷酸化無(wú)影響，這是因?yàn)镻KAc 的作用，PKAc是一種不被阿司匹林抑制的酶。服用阿司匹林治療慢性炎癥性疾病的患者血清濃度范圍為1 000～5 000 μmol/L，故通過(guò)口服給藥很容易達(dá)到100 μmol/L的血清濃度[7]。因此，本研究闡明了阿司匹林可以預(yù)防GERD患者發(fā)展為BE(在應(yīng)對(duì)酸和膽汁的反流過(guò)程中其鱗狀上皮表達(dá)CDX2)的分子機(jī)制。

最后，本研究結(jié)果可能對(duì)采用射頻消融術(shù)(RFA)治療的BE患者的管理有重要意義，RFA是目前消除發(fā)育異常的BE的首選內(nèi)鏡治療方式[2]。RFA使用以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的球囊電極，向化生的黏膜提供射頻能量，造成廣泛的周圍熱損傷。然后，患者接受質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)治療，以控制酸反流和使消融的化生柱狀黏膜與新鱗狀上皮愈合。早期研究表明，RFA后Barrett化生復(fù)發(fā)率較低，但最近的研究顯示復(fù)發(fā)率高得多，在一些報(bào)道中，4年內(nèi)復(fù)發(fā)率接近50%[20]。這些復(fù)發(fā)的原因尚不清楚，但很可能是由于GERD誘導(dǎo)的食管損傷引起的，因?yàn)镻PIs治療并不能完全阻止這種損傷。即使是高劑量的PPIs，也不會(huì)使許多BE患者的食管酸暴露正?；?，盡管有PPIs治療，但膽汁酸反流仍然存在[21]。如果復(fù)發(fā)性Barrett化生的發(fā)病機(jī)制涉及反流的酸和膽鹽觸發(fā)IκB-NF-κB-PKAc復(fù)合物和NF-κB信號(hào)的激活導(dǎo)致CDX2的表達(dá)，那么阿司匹林治療可能會(huì)中斷這一過(guò)程。因此，本研究結(jié)果為阿司匹林(聯(lián)合PPIs)阻斷食管上皮細(xì)胞中NF-κB的激活從而防止RFA后復(fù)發(fā)性Barrett化生的臨床試驗(yàn)提供了分子理論基礎(chǔ)。

總之，本研究證明了合并BE與不合并BE的GERD患者食管鱗狀細(xì)胞在酸和膽鹽激活NF-κB通路的強(qiáng)度方面存在顯著差異，這可解釋充分激活的NF-κB通路僅在BE患者的鱗狀細(xì)胞中引起CDX2表達(dá)。此外，可以通過(guò)使用阿司匹林抑制IκB的磷酸化來(lái)阻斷酸和膽鹽誘導(dǎo)的CDX2表達(dá)。這些結(jié)果闡明了分子機(jī)制并可以解釋為什么一些GERD患者會(huì)發(fā)展成BE而其他人卻未發(fā)展成BE，以及為什么阿司匹林可以防止BE的發(fā)展。