蘭 慧， 陽(yáng) 敬， 張 郴， 李姝梅

(紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南蒙自 661199)

大黃為蓼科植物唐古特大黃、掌葉大黃或藥用大黃的干燥根及根莖,它主要含有蒽醌類、鞣類、二苯乙烯類、苯丁酮類等多種化學(xué)成分。從大黃中分離出的蒽醌類化合物主要有蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等[1]。大黃中所有化學(xué)成分幾乎都具有多種藥理活性[2 - 3]。其中，大黃素又稱朱砂蓮甲素，具有抗菌、抑制免疫、解痙、止咳、抗癌等藥理作用[4]。目前，大黃素的分析方法主要有分光光度法[5]、高效液相色譜法[6]、薄層色譜法[7]等。電化學(xué)方法因其儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，低成本和靈敏度高已被廣泛應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)[8]。

納米材料具有良好的導(dǎo)電性及生物相容性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建中。石墨烯具有特殊的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學(xué)、電學(xué)、光學(xué)及催化性能，在納米電子學(xué)、微電子學(xué)、儲(chǔ)能材料以及復(fù)合材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)由于這種碳納米材料具有良好的導(dǎo)電性及生物相容性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器的制備及電催化領(lǐng)域。但是石墨烯容易聚集，因此對(duì)其進(jìn)行有效的功能化修飾非常重要[9]。聚多巴胺(PDA)是貝殼、蚌等生物分泌的粘性蛋白的主要成分，具有極強(qiáng)的粘附性，能穩(wěn)定地固定在各種基質(zhì)上。Lee等[10]以多巴胺(DA)為單體，通過(guò)簡(jiǎn)單的自聚合反應(yīng)在各種基質(zhì)表面形成了仿生PDA膜，該膜不僅具有良好的粘附性，同時(shí)保持了原有單體良好的生物相容性，被廣泛地應(yīng)用于對(duì)Au和Pt納米顆粒、碳納米管、石墨烯氧化物的表面修飾。DA特有的還原性可以作為氧化石墨烯(GO)的還原劑。PDA良好的粘附性和生物相容性又可以作為石墨烯(GNs)的保護(hù)劑。

本文利用PDA膜對(duì)基底極強(qiáng)的結(jié)合力及其良好的生物活性，通過(guò)一步反應(yīng)法合成具有仿生功能的GNs/PDA納米復(fù)合材料，并將其作為基底材料將HAuCl4原位還原為Au納米粒子負(fù)載在GNs/PDA納米復(fù)合材料表面，將其用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)大黃素，實(shí)現(xiàn)了大黃素的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海-恒科儀器有限公司)；CP213電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；SK5200HP超聲波清洗器(上海科特超聲儀器有限公司)；AMI202-H數(shù)顯電動(dòng)攪拌機(jī)(上海昂尼儀器)；TG18-WS離心機(jī)(上海島析實(shí)業(yè)有限公司)。

大黃素對(duì)照品(批號(hào)：20131121)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：20130909)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；石墨烯(GNs)，阿拉丁試劑有限公司；HCl、檸檬酸三鈉、NaBH4、HAuCl4、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甲醇為分析純，其它所用試劑均為分析純。水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1GNs/PDA復(fù)合材料的制備采用Hummers’方法[8]制備氧化石墨烯(GO)。稱取60 mg GO，溶于80 mL 水中，超聲分散2 h后加入40 mg DA，冰浴超聲30 min，攪拌下加入40 mL 12.5 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)，于80 ℃水溶反應(yīng)48 h，用水離心清洗數(shù)次直到除去多余的DA，產(chǎn)物溶于水中[11]。為了對(duì)比，本文還參考文獻(xiàn)方法制備了還原石墨烯納米材料[12 - 13]。

1.2.2GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料的制備參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[14]制備GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料。具體方法如下：取1 mL 10 mg·mL-1GNs/PDA納米復(fù)合物，加入10 mg(0.5 mL 20 mg·mL-1)HAuCl4和14.705 mg檸檬三酸鈉，整個(gè)溶劑的體積為40 mL，冰浴超聲30 min，加入0.6 mol·L-1NaBH4，攪拌30 h后，用水離心清洗后，備用。

1.2.3傳感器構(gòu)建先將玻碳電極(GCE，直徑為3 mm)依次用1.0、0.3和0.05 μL的Al2O3粉末在麂皮上拋光成鏡面，然后分別在1.0 mol·L-1HNO3、無(wú)水乙醇和水中各超聲清洗1 min，室溫晾干。移取7 μL 制備好的GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料滴涂在GCE表面，室溫晾干保存，備用。

1.2.4電化學(xué)測(cè)試采用三電極體系，修飾電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在B-R緩沖溶液中進(jìn)行，循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)的電位區(qū)間為-0.8～0.2 V，掃描速率為50 mV·s-1。

1.2.5樣品的提取稱取大黃粉末0.5 g，加甲醇100 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，再加HCl 5 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分兩次振搖提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，三氯甲烷溶解，置于50 mL容量瓶中，并用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃下保存，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見(jiàn)光譜表征

如圖1所示。GO在波長(zhǎng)230 nm處有最大吸收峰(圖1曲線b)，GNs的吸收峰較GO紅移了33 nm(圖1曲線c)，表明GO已被成功的還原為GNs。從圖1中曲線a可以看出，DA在280 nm處有最大吸收峰，GNs/PDA在267 nm處有一個(gè)強(qiáng)的紫外的吸收峰(圖1曲線d)，這是由于GNs與PDA之間的相互作用力所致。GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料在562 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰(圖1曲線e)，這個(gè)峰是Au納米的紫外吸收峰。結(jié)果表明成功制備了GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料。

2.2 X射線衍射分析(XRD)

采用pert3 powder型X射線衍射儀對(duì)GNs、GNs/PDA和GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料進(jìn)行XRD表征。從圖2a可以看出GNs在2θ=22.19° 附近出現(xiàn)一個(gè)新的寬衍射峰，這是由于化學(xué)還原后，移除了GO表面大量的含氧功能基團(tuán)，使得層與層之間的晶面間距減小。同時(shí)GNs的衍射峰變寬，峰強(qiáng)大大減弱，這是由于還原后，石墨片層尺寸更加縮小，晶體結(jié)構(gòu)完整性進(jìn)一步被破壞，無(wú)序度增加。圖2b是GNs/PDA的XRD圖，可以看到在2θ為24.9°出現(xiàn)一個(gè)寬的衍射峰，與單純GNs的衍射峰形類似，表明GNs表面已成功的被聚多巴胺膜包裹。圖2c為GNs/PDA/Au的XRD圖，其晶格衍射峰位置(2θ)分別為38.20°、44.46°、64.56°、77.52°和81.70°，分別對(duì)應(yīng)Au納米粒子的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)晶面，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[9]的Au納米粒子的XRD特征峰吻合。GNs/PDA/Au的XRD峰中GNs/PDA的XRD特征峰很不明顯，可能是因?yàn)锳u納米粒子在GNs/PDA的表面負(fù)載密度太高，而掩蓋了GNs/PDA的峰。

2.3 GNs/PDA/Au的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)表征

采用SEM和TEM對(duì)制備的GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料進(jìn)行形貌表征。從圖3A中可以看出許多的Au納米粒子均勻的分散在GNs/PDA表面，只有少量的Au納米粒子有團(tuán)聚現(xiàn)象，這可能是由于PDA作為一個(gè)良好的保護(hù)劑和連接劑有利于Au納米粒子的均勻負(fù)載。從圖3B中可以看出Au納米粒子的平均粒徑約為40 nm，從圖中還明顯的看出了GNs/PDA的膜狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明本文成功制備了GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料。

圖1 DA(a)、GO(b)、GN(c)、GN/PDA(d)和GN/PDA/Au(e)的紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of DA(a),GO(b),GN(c),GN/PDA(d) and GN/PDA/Au(e)

圖2 GNs(a)、GNs/PDA(b)和GNs/PDA/Au(c)的X射線衍射(XRD)圖Fig.2 XRD of GNs(a),GNs/PDA(b) and GNs/PDA/Au(c)

圖3 GNs/PDA/Au的掃描電鏡(SEM)圖(A)和透射電鏡(TEM)圖(B)Fig.3 SEM image(A)and TEM (B)of GNs/PDA/Au

2.4 大黃素的電化學(xué)行為

考察不同材料修飾的GCE在含有22.2 μmol·L-1的大黃素的pH=5.33的B-R溶液中的循環(huán)伏安行為(圖4)。從圖中可以看出，GNs修飾的電極(曲線a)和GNs/PDA修飾電極(曲線b)在含大黃素的B-R 緩沖溶液中無(wú)電化學(xué)響應(yīng)，GNs/PDA/Au修飾的電極(曲線c)在-0.7～0.1 V之間有一對(duì)較好的可逆氧化還原峰，其中還原峰電位為-0.154 mV，氧化峰電位為：-0.576 mV，其電位差ΔEp為421 mV，這對(duì)氧化還原峰可能來(lái)源于大黃素中兩個(gè)羰基的氧化[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料對(duì)大黃素的檢測(cè)具有良好的電化學(xué)活性。

22.2 μmol·L-1大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在pH=5.33的B-R 緩沖溶液中，于-0.8～0.2 V電位范圍，富集180 s的條件下進(jìn)行連續(xù)循環(huán)伏安掃描(圖5)。第一次掃描氧化峰電位為-0.56 V,第二次掃描后氧化峰電位負(fù)移到-0.569 V,第四次掃描后氧化峰電位負(fù)移到-0.572 V,且峰電流隨掃描次數(shù)的增加而增大，說(shuō)明大黃素在電極表面的反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)聚合過(guò)程[16]。

圖4 大黃素在不同修飾電極上的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of emodin at the different modified electrodesa：GNs/GCE;b：GNs/PDA/GCE；c:GNs/PDA/Au/GCE.t=140 s.

圖5 大黃素在GNs/PDA/Au/GCE上的連續(xù)循環(huán)伏安掃描曲線Fig.5 Continuous cyclic voltammograms of 22.2 μmol·L-1 emodin at GNs/PDA/Au/GCE in B-R bufter

圖6 大黃素在GNs/PDA/Au/GCE上于不同pH B-R緩沖溶液的循環(huán)伏安曲線圖Fig.6 Cyclic voltammograms of emodin at GNs/PDA/Au/GCE in different pHpH:1.89,2.36,2.56,3.29,4.56,5.33,5.72,6.37,7.24,t=180 s.

2.5 pH的選擇

考察了B-R緩沖溶液pH對(duì)大黃素檢測(cè)的影響。從圖6中可以看出隨著pH從1.89增大到5.33時(shí)，大黃素的峰電流逐漸增加，繼續(xù)增加溶液的pH時(shí)，峰電流反而下降，所以選擇pH=5.33的B-R緩沖溶液為最佳檢測(cè)溶液。

2.6 富集時(shí)間的選擇

采用GNs/PDA/Au/GCE，在B-R緩沖溶液中，用差分脈沖伏安法對(duì)大黃素富集時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在20～140 s范圍內(nèi)，隨著富集時(shí)間的增加，峰電流依次增加，富集時(shí)間繼續(xù)增大到160 s時(shí)，峰電流反而減小。這可能是由于大黃素在GNs/PDA/Au/GCE表面達(dá)到了飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加富集時(shí)間，會(huì)有部分大黃素非特異性吸附在電極表面，這樣不但不能提高電化學(xué)信號(hào)，反而會(huì)阻礙電子的傳遞，導(dǎo)致峰電流降低。所以選擇140 s作為大黃素的最佳富集時(shí)間。

2.7 線性范圍及檢測(cè)限

在上述最佳條件下，采用差分脈沖伏安法對(duì)大黃素進(jìn)行檢測(cè)。從圖7A可以看出，隨著大黃素濃度的增加，峰電流逐漸增加；從圖7B可以看出，大黃素在GNs/PDA/Au/GCE上的峰電流與濃度在1.48～119.63 μmol·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ip(μA)=0.08c+5.78，線性相關(guān)系數(shù)是0.9911，檢測(cè)限為5.0 μmol·L-1。

圖7 (A)不同濃度大黃素的差分脈沖伏安圖;(B)峰電流與大黃素的濃度之間的線性響應(yīng)曲線Fig.7 (A)Differential pulse voltammograms of different concentrations of emodin at GNs/PDA/Au/GCE，(B)Linear response curve between peak current and emodin concentrationcEmodin:1.48，2.96，7.4，11.1，16.03，23.43，45.63，60.43，77.7，97.43 and 119.63 μmol·L-1.pH=5.33,t:140 s,scan rate:50 mV·s-1.

2.8 樣品分析及回收率

在pH=5.33的B-R緩沖溶液中，采用差分脈沖循環(huán)伏安法測(cè)定了大黃藥材中大黃素的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。大黃藥材中大黃素的含量平均為1.2 mg·g-1，加標(biāo)回收率在98.4%～102.6%范圍，表明方法準(zhǔn)確度較高，完全滿足實(shí)際樣品測(cè)定需求。

表1 大黃素樣品的加標(biāo)回收測(cè)定

3 結(jié)論

本文成功制備了石墨烯/聚多巴胺復(fù)合納米材料，將其作為金納米粒子的載體，制備GNs/PDA/Au復(fù)合納米材料，對(duì)合成的材料進(jìn)行表征。將制備的GNs/PDA/Au用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器對(duì)大黃素進(jìn)行檢測(cè)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)大黃素，線性范圍為16.03～119.63 μmol·L-1，檢測(cè)限為5.0 μmol·L-1。該電化學(xué)檢測(cè)方法適用于對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，可應(yīng)用到藥物分析中。