張鳳英

[摘要] 目的 探討年齡相關(guān)性聽力損失對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 方法 取4周齡昆明小鼠14只，隨機(jī)分為對照組和模型組，模型組小鼠每日腹腔注射150 mg/（kg·d）的D-半乳糖誘導(dǎo)年齡相關(guān)性聽力損失（ARHL）模型，對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，持續(xù)2個月。分別于注射前及注射后1個月和2個月，檢測小鼠聽力的損害。聽腦干反應(yīng)（ABR）檢測小鼠聽覺功能，Morris水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)以及能力。 結(jié)果 造模2個月后模型組小鼠ABR閾值顯著升高，并且與對照組相比，存在顯著性差異（P<0.01），ARHL小鼠模型造模成功。ARHL小鼠潛伏期和上臺前路程均顯著長于對照組（P<0.05），并且在目標(biāo)象限游泳時間和穿越平臺次數(shù)也顯著減少（P<0.05）。結(jié)論 年齡相關(guān)性聽力損失模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，記憶保持能力也有所下降。

[關(guān)鍵詞] 年齡相關(guān)性聽力損失;學(xué)習(xí)記憶能力;聽腦干反應(yīng);Morris水迷宮

[中圖分類號] R392? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）05-0031-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of age-related hearing loss on learning and memory ability in mice. Methods 14 Kunming mice of 4 weeks old were randomly divided into control group and model group. The mice in the model group were intraperitoneally injected with 150 mg/（kg·d）D-galactose to induce age-related hearing loss （ARHL） model. The control group was intraperitoneally injected with the same dose of normal saline for 2 months. The hearing impairment of the mice was tested before injection and at 1 month and 2 months after injection， respectively. The auditory brainstem response（ABR） was used to detect the auditory function of mice， and the Morris water maze test was used to detect the learning and ability of mice. Results After 2 months of modeling， the ABR threshold of the model group was significantly increased， and there was a significant difference between the model group and the control group（P<0.01）. The ARHL mouse model was successfully modeled. The latency and the pre-stationary path of ARHL mice were significantly longer than that of the control group（P<0.05）， and the swimming time and the number of crossing platforms in the target quadrant were also significantly decreased in the ARHL mice（P<0.05）. Conclusion The age-related hearing loss model mice have decreased learning， memory ability and memory retention.

[Key words] Age-related hearing loss; Learning and memory ability; Auditory brainstem response; Morris water maze

老年性耳聾即年齡相關(guān)性聽力損失（age-related hearing loss，ARHL），是指隨著年齡的增長，聽覺器官發(fā)生緩慢的進(jìn)行性老化，主要表現(xiàn)為高頻聽力下降，并逐漸累及低頻聽力。近年研究發(fā)現(xiàn)學(xué)者發(fā)現(xiàn)[1]，ARHI患者數(shù)量比以前有明顯增加。并且研究發(fā)現(xiàn)在60歲以上人群中，35%～55%患有不同程度的聽力障礙[2]，而相關(guān)研究預(yù)測至2050年60歲以上人口將達(dá)4.91億，因此ARHI患者數(shù)量巨大，越來越受到人們的關(guān)注[3]。2014年Frank Lin等的研究顯示聽力損失與癡呆、抑郁、平衡失調(diào)和跌倒風(fēng)險的增加相關(guān)，且發(fā)生癡呆的風(fēng)險隨著基線聽力損失的嚴(yán)重程度線性增加（每10 dB聽力損失風(fēng)險增加1.27倍）[4，5]。Taljaard和Olaithe于2016年發(fā)布了一項由5534名聽力損失患者參與的大型Meta分析顯示聽力受損程度與一般認(rèn)知之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且聽力治療可以改善認(rèn)知功能[6]。但是關(guān)于年齡相關(guān)性聽力損失對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究較少，因此本研究對半乳糖衰老模型大鼠進(jìn)行研究，明確年齡相關(guān)性聽力損失對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立[7，8]

取4周齡昆明小鼠14只，隨機(jī)分為對照組和模型組，模型組小鼠每日腹腔注射150 mg/（kg·d）的D-半乳糖誘導(dǎo)老年性耳聾模型，對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，持續(xù)2個月。分別于注射前及注射后1個月和2個月，檢測小鼠聽力的損害。本研究通過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 聽腦干反應(yīng)（ABR）檢測小鼠聽覺功能[9]

聽腦干反應(yīng)檢測在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。小鼠用1%戊巴比妥鈉90 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉后，將電極的正極置于動物顱頂正中皮下，負(fù)極置于給聲側(cè)耳廓后下方，接地電極置于對側(cè)耳廓后下方，屏蔽耳機(jī)距測試小鼠外耳道口0.5 cm。應(yīng)用美國智聽公司Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音刺激，選取8 kHz、12 kHz、24 kHz 3個頻率分別進(jìn)行測試并記錄。重復(fù)率39.1次/s，帶通濾波100～300 Hz，疊加1024次，掃描時程16.0 ms。聲刺激強(qiáng)度從95 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，聽閾判定以剛出現(xiàn)ABR Ⅰ波為準(zhǔn)并至少重復(fù)2次。

1.3 Morris水迷宮實驗[10]

選擇安靜、暗光、恒溫環(huán)境進(jìn)行測試。實驗前將水桶灌以清水至預(yù)定高度（約40 cm），再加入適量白色素，使水成為不透明的乳白色液體，加熱器加熱水溫至25℃。平臺置于第四象限中央，位于水面以下約1.5 cm。訓(xùn)練期依次從4個入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期，停留30 s進(jìn)行下一方向的訓(xùn)練。如果120 s內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，并在平臺上停留30 s后進(jìn)行下一方向訓(xùn)練。定位航行實驗用于評價動物學(xué)習(xí)和記憶能力。前3 d為動物訓(xùn)練期，第4天，依次從第一、二、三象限入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，分別記錄小鼠第1天、第2天、第3天和第4天在水中逃避潛伏期和上臺前路程。空間搜索實驗用于評價動物平臺位置的記憶，即記憶保持能力。第5天撤除平臺，依次從第一、二、三象限入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，分別3次記錄小鼠90 s內(nèi)在目標(biāo)象限游泳時間和穿越平臺次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS18.0進(jìn)行處理和分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR檢測結(jié)果

注射前經(jīng)過不同頻率刺激，對照組和模型組小鼠ABR閾值沒有顯著性差異（P>0.05）;注射造模后1個月，對照組小鼠ABR閾值沒有顯著變化（P>0.05），而模型組小鼠ABR閾值顯著升高（P<0.05），與對照組相比，模型組小鼠ABR閾值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;注射造模后2個月，對照組小鼠ABR閾值沒有顯著變化（P>0.05），而模型組小鼠ABR閾值顯著升高（P<0.01），與對照組相比，模型組小鼠ABR閾值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。造模后模型組小鼠ABR閾值變化穩(wěn)定，造模成功。

2.2 兩組 Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果

Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠潛伏期明顯長于對照組（P<0.05）;并且上臺前路程也顯著長于對照組（P<0.05），見表2。結(jié)果證實年齡相關(guān)性聽力損失模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降。

2.3 兩組Morris水迷宮空間探索實驗結(jié)果

空間探索實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠在目標(biāo)象限游泳時間比對照組顯著減少（P<0.05），并且模型組小鼠穿越平臺次數(shù)也顯著減少（P<0.05），見表3。結(jié)果證實年齡相關(guān)性聽力損失模型小鼠記憶保持能力也有所下降。

3 討論

隨著我國老齡化社會的到來，老年性耳聾的患病率大幅上升，據(jù)不完全統(tǒng)計，2017年已達(dá)到5000萬，預(yù)計到2030年，ARHL預(yù)計將成為疾病負(fù)擔(dān)的前15個原因[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)中、重度聽力損失的老年患者，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的幾率比正常老年人顯著升高[12]。同時一項流行病學(xué)調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)聽覺障礙的患者認(rèn)知功能障礙發(fā)病率升高[13]，并且阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險也增高[14]。另外動物研究也發(fā)現(xiàn)，聽力損失模型小鼠認(rèn)知功能下降，并且研究還發(fā)現(xiàn)聽力損失模型小鼠海馬突觸退變明顯，這一變化可能與認(rèn)知功能下降有關(guān)[15]。

半乳糖衰老模型是目前使用較為廣泛的一種人工老化模型，具有衰老變化明顯、模型穩(wěn)定、耗時短等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究對小鼠進(jìn)行D-半乳糖注射進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模2個月后模型組小鼠ABR閾值顯著升高，并且與對照組相比，存在顯著性差異（P<0.01）。造模后模型組小鼠ABR閾值變化穩(wěn)定，與以往研究結(jié)果一致[7，8]，ARHL小鼠模型造模成功。同時，本研究應(yīng)用Morris水迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1、2、3、4天ARHL小鼠學(xué)習(xí)能力低于對照動物（P<0.05）;隨著學(xué)習(xí)時間的延長，ARHL小鼠潛伏期和上臺前路程逐漸縮短，顯示出學(xué)習(xí)的作用，而第4天ARHL小鼠學(xué)習(xí)能力仍然顯著低于對照組。但在第5天的記憶測試中，ARHL小鼠在目標(biāo)象限游泳時間和穿越平臺次數(shù)顯著低于對照組（P<0.05），顯示ARHL小鼠海馬相關(guān)的空間學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力顯著降低。結(jié)果證實年齡相關(guān)性聽力損失模型小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降，記憶保持能力也有所下降。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、加工及修飾的場所，大量未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集將會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS參與誘導(dǎo)內(nèi)耳毛細(xì)胞的凋亡，從而引起聽力損失，也參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，影響智力發(fā)育，這可能是年齡相關(guān)性聽力損失可以降低小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的潛在機(jī)制。

綜上所述，年齡相關(guān)性聽力損失可以降低小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。因此臨床上針對年齡相關(guān)性聽力損失的老年患者要注意加強(qiáng)鍛煉學(xué)習(xí)記憶能力，必要時采取適當(dāng)治療，改善認(rèn)知功能，延緩阿爾茨海默病的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Franeesco P，Vincenzo S，Davide S，et a1.Age-related hearing impairment and frailty in Alzheimer[J].Frontiers in Aging Neuroseienee，2015，7（9）：113-119.

[2] 莫文權(quán)，楊暉，褚文浩，等.中醫(yī)綜合療法治療老年感音神經(jīng)性耳聾的l臨床隨機(jī)對照研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（8）：68-72.

[3] 胡杰成.我國人口老齡化現(xiàn)狀、趨勢與建議[J].中國經(jīng)貿(mào)導(dǎo)刊，2017，12（1）：59-62.

[4] Lin FR，Metter EJ，OBrien RJ，et al.Hearing loss and incident dementia[J].Arch Neurol，2011，68（2）：214-220.

[5] Lin FR，Albert M.Hearing loss and dementia-who is listening[J].Aging Ment Health，2014， 18（6）：671-673.

[6] Taljaard DS，Olaithe M.The relationship between hearing impairment and cognitive function：A meta-analysis in adults[J].Clin Otolaryngol，2016，41：718-729.

[7] 黃雙.D-半乳糖致小鼠衰老模型劑量和給藥方式探討[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[8] 張海靜，王哲，武瑩，等.耳聾左慈丸對老年性耳聾模型小鼠血清SOD，MDA、PKC的影響[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2016，14（l）：136-138.

[9] 張博，陳穎，黃喜，等.參芎注射液對順鉑致小鼠耳毒性及耳蝸Caspase-3表達(dá)的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2016，20（23）：1-4.

[10] 于亞峰，翟豐，戴春富，等.C57BL/6J小鼠聽力損失與認(rèn)知功能下降的相關(guān)性[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，91（34）：2430-2434.

[11] Mathers CD，Loncar D.Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030[J].PLoS Med，2006， 3（11）： e442-446.

[12] Davies HR，Cadar D，Herbert A，et al.Hearing impairment and incident dementia：Findings from the English longi-tudinal study of ageing[J].J Am Geriatr Soc，2017，6（22）：1-8.

[13] Fischer ME，Cruickshanks KJ，Schubert CR，et al.Age-related sensory impairments and risk of cognitive impairment[J].J Am Geriatr Soc，2016，64（10）：1981-1987.

[14] Gates GA，Beiser A，Rees TS，et al.Central auditory dysfunction may precede the onset of clinical dementia in people with probable Alzheimers disease[J].J Am Geriatr Soc，2002， 50（3）：482-488.

[15] 王馳，柳柯，趙立東，等.老年性聾耳蝸帶狀突觸數(shù)量在時空上的改變[J].中華耳科學(xué)雜志，2016，14（1）：32-36.

（收稿日期：2018-11-22）