麻忠武 俞海波 邱笑瓊 宋洪亮 金肖丹 賀亞東

[摘要] 目的 探討新型的靶向性表皮生長因子受體（EGFR）殼聚糖蘆薈大黃素納米微球?qū)θ艘认侔┘毎鸖W1990細胞生長的抑制作用及其對細胞增殖周期和凋亡的影響。 方法 采用四甲基偶氮唑藍法（MTT）觀察抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球在不同作用時間內(nèi)對在體外培養(yǎng)的SW1990細胞增殖的影響，同時應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞增殖周期及凋亡率的變化。 結(jié)果 蘆薈大黃素能對胰腺癌細胞SW1990的增殖起到抑制作用（P<0.05），抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球可明顯增強蘆薈大黃素對人胰腺癌細胞SW1990生長的抑制作用（P<0.05），使細胞凋亡率升高達（40.56±1.24）%（P<0.05），在G0/G1期阻滯細胞增殖（P<0.05）。 結(jié)論 抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔㏒W1990細胞增殖的抑制作用顯著，可能為將來中藥對胰腺癌的靶向性治療提供新的研究方向。

[關(guān)鍵詞] 蘆薈大黃素;胰腺癌細胞SW1990;凋亡;殼聚糖

[中圖分類號] R735.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）07-0015-04

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of novel targeted epidermal growth factor receptor（EGFR） chitosan aloe-emodin nanospheres on the growth of human pancreatic cancer cell line SW1990 and its effect on cell proliferation cycle and apoptosis. Methods The effect of anti-EGFR aloe-emodin-encapsulated chitosan nanospheres on the proliferation of SW1990 cells cultured in vitro was observed by MTT assay. Flow cytometry was also applied to detect changes in cell proliferation cycle and apoptosis rate. Results Aloe-emodin could inhibit the proliferation of pancreatic cancer cell line SW1990（P<0.05）. Anti-EGFR aloe-emodin-encapsulated chitosan nanospheres could significantly enhance the growth inhibition effect of aloe-emodin on human pancreatic cancer cell line SW1990 （P<0.05）， which increased the apoptosis rate to（40.56±1.24）%（P<0.05）， and could made cell proliferation arrested in G0/G1 phase（P<0.05）. Conclusion The anti-EGFR aloe-emodin-encapsulated chitosan nanospheres have significant inhibitory effects on the proliferation of pancreatic cancer SW1990 cells， which may provide a new research direction for the traditional Chinese medicine targeted treatment of pancreatic cancer in the future.

[Key words] Aloe-emodin;Pancreatic cancer cell SW1990;Apoptosis;Chitosan

胰腺癌惡性程度高，預(yù)后極差，5年點生存率約為5%[1]。治療胰腺癌的首選方法是根治性手術(shù)切除，但可切除率低于20%。胰腺癌患者主要的治療措施是化療，但目前胰腺癌的化療藥物缺乏靶向性和特異性，治療腫瘤效果不佳。因此研制新型胰腺癌化療藥物在藥物研究領(lǐng)域受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤作用更是當前藥物基礎(chǔ)研究的熱點項目。本實驗通過研制新型的靶向性表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）殼聚糖蘆薈大黃素納米藥物，探討其體外對胰腺癌SW1990細胞生長的抑制作用及其對細胞增殖周期和凋亡的影響，為其他中藥治療胰腺癌提供新思路和途徑。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

（1）主要試劑：蘆薈大黃素（Delta天然有機化合物信息中心）、載蘆薈大黃素新型納米微球由溫州市醫(yī)藥科學(xué)研究所協(xié)作采用以殼聚糖為基質(zhì)，通過膜透析技術(shù)，制備殼聚糖負載蘆薈大黃素納米微球，詳細微球制作方法參考Hyung PJ等[2]研究，包括蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球（GC-DDP）、抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球（AbC-GC-DDP）（冷凍干燥保存的GC-DDP納米粒，溶于蒸餾水中，將抗EGFR抗體與抗殼聚糖抗體結(jié)合制成）、空白殼聚糖納米微球（GC）。甲基噻唑（MTT）購于美國Sigma公司的二甲基亞砜（DMSO）、N-羥基琥珀酰亞胺乙二醇殼聚糖購于杭州四季青生物工程公司的胎牛血清（PBS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺購于Santa Cruz公司的抗殼聚糖抗體與購于美國Hyelone公司的抗EGFR抗體購于美國Hyclone公司的RPMI1640細胞培養(yǎng)基。（2）實驗設(shè)備：自動溫控細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Form），酶標儀、酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-tek公司），細胞計數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠），F(xiàn)ACSC alibur流式細胞儀（美國BD公司）。試驗開展于2017年3月～2018年2月。

1.2 實驗細胞

所需細胞系為購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫的人胰腺癌細胞系SWl990，培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于相對濕度為95%、恒溫37℃、含5%CO2的環(huán)境中單層生長，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗方法

①MTT實驗? 分組：A組：抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球（AbC-GC-DDP）組;B組：蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球（GC-DDP）組;C組：蘆薈大黃素組（aloe-emodin，AE）;D組：空白殼聚糖納米微球（GC）組;E組：無藥對照組（只加RPMI-1640培養(yǎng)液）;A、B、C組蘆薈大黃素濃度一致為60 μmol/L[3，4]，以RPMI-1640培養(yǎng)液配置。取對數(shù)生長期的SW1990細胞消化、計數(shù)，以5×103/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后給藥。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育6 h，培養(yǎng)完成后去除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜，輕輕震蕩，溶解后用酶標儀測OD值。細胞抑制率（IR）=（1-給藥組OD值/無藥組OD值）×100%。②細胞周期測定? 采用流式細胞術(shù)分析[5]，即分別收集經(jīng)A、B、C、D、E組處理24 h后的SW1990細胞，先用胎牛血清洗滌2次，再加入70%乙醇（-20℃預(yù)冷的），在4℃恒溫固定過夜;去除乙醇液，再次用胎牛血清洗滌1次，加入RNase 50 μg/mL，在37℃恒溫水浴30 min;加染色劑碘化乙啶（PI），在避光條件下染色30 min，最后用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，對組間差異采用方差分析;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或者方差齊性，則采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔┘毎鸖W1990生長的影響

蘆薈大黃素對胰腺癌細胞SW1990的增殖有一定的抑制作用，蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球在對胰腺癌細胞SW1990的抑制率上與蘆薈大黃素無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔㏒W1990的抑制率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著時間的推移，對SW1990細胞株的抑制率呈明顯上升趨勢，該抑制作用有一定的時間延續(xù)性，藥物具有明顯的緩釋作用。見封三圖1、表1。

2.2 抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔┘毎鸖W1990的凋亡的影響

各組干預(yù)SW1990細胞株24 h后細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，A組細胞凋亡率最高，B、C組細胞凋亡率相當，D、E組中僅有極少量的凋亡細胞存在。見表2。

2.3 抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔┘毎鸖W1990增殖周期的影響

給予蘆薈大黃素干預(yù)后，本研究觀察到胰腺癌SW 1990細胞周期各時相的細胞數(shù)占比與對照發(fā)生了明顯的改變，其中G0/G1期腫瘤細胞比例顯著增加，S期腫瘤細胞比例減少，尤其是A組在胰腺癌SW1990細胞在G0/G1期的腫瘤細胞比例最高，與對照組相比具有顯著差異（P<0.01），見封三圖2。

3 討論

蘆薈大黃素（aloe emodin，AE）存在于蘆薈、決明子及大黃等中草藥中，屬于蒽醌類物質(zhì)，因其含有蒽醌環(huán)和兩個酚羥基，決定其具有抑制腫瘤及清除氧自由基等多種生物活性。因此近年來，作為一種傳統(tǒng)中藥中重要的抗腫瘤成分，蘆薈大黃素被國內(nèi)外研究人員密切關(guān)注。研究表明，蘆薈大黃素對多種癌癥具有抑制腫瘤活性作用。如利用蘆薈大黃素的光動力活性，蘆薈大黃素可通過重構(gòu)PKC-delta介導(dǎo)的細胞骨架來殺死人肺癌細胞[6]，也可提高肺癌細胞對anoikis 再敏感性[7]。蘆薈大黃素可抑制人口腔癌KB細胞的生長[8]。蘆薈大黃素能夠抑制具有高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。對于子宮頸癌，蘆薈大黃素也具有一定的作用，如蘆薈大黃素可使得人子宮頸癌細胞停滯于G2/M期，增強子宮頸癌細胞的分化[10]。

納米技術(shù)作為一種新興技術(shù)，納米藥物即是以納米技術(shù)研制的藥物，其表面通過生物或者理化修飾后可使藥物具有靶向性作用，即稱為靶向納米藥物[11]。殼聚糖是一種可生物天然分解的高分子聚合物陽離子材料，近年來在臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。殼聚糖在靶向基因藥物研發(fā)、藥物控制性釋放等方面廣泛應(yīng)用，是目前醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的熱點之一[12，13]。EGFR在胰腺癌中的表達率可達60%左右[14]。已有研究證實EGFR可作為胰腺癌治療的理想靶點之一，通過將抗EGFR抗體與EGFR蛋白進行特異性結(jié)合，可以提高吉西他濱納米?？挂认侔┘毎陌邢蛐耘c有效性[15]。殼聚糖負載蘆薈大黃素納米微球的制備是通過膜透性技術(shù)，在不影響蘆薈大黃素的抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上，使其與殼聚糖基質(zhì)結(jié)合，然后將抗殼聚糖抗體與抗EGFR抗體做成抗體聯(lián)合體，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點，將殼聚糖負載蘆薈大黃素納米微球輸送至胰腺癌細胞，使其具有一定的靶向性。因此，本研究所用抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球即由該法制備，并開展其對人胰腺癌細胞株SW1990的體外抑制效應(yīng)的研究。

本文在離體實驗中，采用MTT法觀測了抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)θ艘认侔┘毎闟W1990的體外增殖抑制效果，結(jié)果顯示：蘆薈大黃素對胰腺癌細胞SW1990具有一定的抑制增殖的生物活性，且抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球?qū)σ认侔┘毎鸖W1990的增殖抑制活性明顯增強，且隨著時間的推移，對SW1990細胞株的抑制率呈明顯上升趨勢，有一定的時間延續(xù)性，藥物具有明顯的緩釋作用。本研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素具有誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡的作用，從而實現(xiàn)對其細胞增殖的生物抑制作用。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是多數(shù)化療藥物的共同作用機制。研究表明蘆薈大黃素可促使線粒體膜電位喪失，阻滯細胞周期、誘導(dǎo)U87膠質(zhì)細胞凋亡[16]。蘆薈大黃素可以通過上調(diào)促凋亡蛋白和下調(diào)抗凋亡蛋白，誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，阻滯其細胞周停滯在G1期[17]。實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)含蘆薈大黃素的各組處理后，細胞中出現(xiàn)大量凋亡小體，且經(jīng)抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球處理的SW1990細胞株中凋亡小體比例最高，凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？赡艿脑蚴茿E誘導(dǎo)細胞線粒體結(jié)構(gòu)改變，通過增加細胞膜通透性同時降低細胞膜電位，激活Caspase及促凋亡因子的活性，促使細胞色素C釋放入細胞質(zhì)誘發(fā)細胞凋亡。亦有AE通過降低Akt/mTOR信號通路表達并降低其磷酸化水平，而達到促使腫瘤細胞自噬、凋亡的可能[18]。當然具體的誘導(dǎo)凋亡機制或者自噬機制，需要進一步的實驗研究去闡明。大量研究表明，AE對腫瘤細胞的分裂周期產(chǎn)生干擾，可在不同細胞周期起到阻滯作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖，起到抗癌作用。Lin ML等[20]通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細胞Hep3B在AE的作用下S期細胞占比明顯升高，AE可降低細胞周期蛋白A（Cyclin A）和細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表達水平，破壞編碼CARP（Caspase associated RING protein）的mRNA穩(wěn)定性，從而線粒體死亡途徑激活，阻滯細胞于S期。Suboj P等[21]研究發(fā)現(xiàn)AE能通過降低細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）和細胞周期依賴性蛋白激酶1（Cyclin-dependent kinase 1，CDK1）的表達水平，將結(jié)腸癌細胞阻滯于G2/M期。通過流式細胞技術(shù)試驗，本研究發(fā)現(xiàn)將細胞阻滯在G0/G1期，是蘆薈大黃素抑制胰腺癌細胞增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。G0/G1期為細胞分裂后期，其中G1期作為細胞周期的關(guān)鍵階段，其主要是為DNA復(fù)制及蛋白合成做準備工作，只要正調(diào)節(jié)蛋白在G1期內(nèi)合成量累積到一定水平，細胞就可以脫離對于細胞外生長因子的依賴，而自主順利完成整個細胞周期[19]。我們發(fā)現(xiàn)抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球能增強蘆薈大黃素對胰腺癌細胞細胞周期的抑制作用且有一定的靶向性，誠然其作用機理尚待開展更深入的實驗研究。

綜上所述，抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球在體外對胰腺癌細胞具有一定的靶向性和顯著的抑制作用，是具有潛在發(fā)展前景的抗胰腺癌中藥。為提高具有抗癌作用的中藥對胰腺癌的靶向性，本實驗提供了一個可行的思路及發(fā)展方向。對抗EGFR蘆薈大黃素包埋的殼聚糖納米微球抗腫瘤及靶向性的機制研究，仍需基礎(chǔ)動物實驗研究以進一步闡明。

[參考文獻]

[1] Jemal A，sigel R，Wand E，et al.Cancer statistics，2008[J].CA Cancer J Clin，2008，58（2）：71-96.

[2] Hyung PJ，Kwon S，Lee M，et al. Self-assembled nanoparticles based on glycol chitosan bearing hydr-ophobic moieties as carriers for doxorubicin：In vivo biodistribution and anti-tumor activity[J]. Biomaterials，2006，27（1）：119-126.

[3] 南菁，秦云霞，劉晶，等. 蘆薈大黃素對人胃癌細胞HGC-27增殖周期及凋亡的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，16（6）：919-921.

[4] 楊賓，付強，王亞娟，等. 蘆薈大黃素對人結(jié)腸癌細胞SW480增殖周期及凋亡的影響[J].山西中醫(yī)，2008，24（6）：48-50.

[5] Chen YC，Shen SC，Lee WR，et al.Emodin induces apoptosis in human promyeloleukemic HL-60 cells accompanied by activation of caspase 3 cascade but independent of reactive oxygen species production[J].Biochem Pharmacol，2002，64（12）：1713-1724.

[6] Chang WT，You BJ，Yang WH，et al. Protein kinase C delta-mediated cytoskeleton remodeling is involved in aloe-emodin-induced photokilling of human lung cancer cells[J]. Anticancer Res， 2012，32（9）：3707-3713.

[7] Lee HZ，Yang WH，Hour MJ，et al. Photodynamic activity of aloe-emodin induces resensitization of lung cancer cells to anoikis[J]. Eur J Pharmacol，2010，648（1-3）：50-58.

[8] Xiao B，Guo J，Liu D，et al. Aloe-emodin induces in vitro G2/M arrest and alkaline phosphatase activation in human oral cancer KB cells[J]. Oral Oncol，2007，43（9）：905-910.

[9] He ZH，Huang YQ，Weng SF，et al. Effect of Aloe-emodin on invasion and metastasis of high metastatic breast cancer MDA-MB-231 cells[J]. Zhong Yao Cai，2013，36（9）：1481-1485.

[10] Guo JM，Xiao BX，Liu Q，et al. Anticancer effect of aloe-emodin on cervical cancer cells involves G2/M arrest and induction of differentiation[J]. Acta Pharmacol Sin，2007， 28（12）：1991-1995.

[11] Liu Y，Miyoshi H，Nakamura M. Nanomedicine for drug delivery and imaging：A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles[J]. Int J Cancer，2007，120（12）：2527-2537.

[12] 孫晉敏，夏正東，周士東，等.負載As_2O_3殼聚糖納米粒的藥代動力學(xué)及其毒性觀察[J].中國組織工程研究，2011，15（12）：2166-2170.

[13] Veiseh O，Kievit FM，F(xiàn)ang C，et al. Chlorotoxin bound magnetic nanovector tailored for cancer cell targeting，imaging，and siRNA delivery[J]. Biomaterials，2010，31（31）：8032-8042.

[14] Jimeno A，Rubioviqueira B，mador ML，et a1.Dual mitogenactivated protein kinase and epidermal growth factor receptor inhibition in biliary and pancreatic cancer[J].Mol Cancer Ther，2007，6（3）：1079-1088.

[15] 俞海波，陳海川，王哲近，等.靶向殼聚糖新型納米藥物體外抗胰腺癌細胞的實驗研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2017， 46（6）：84-87.

[16] Ismail S，Haris K，Abdul Ghani AR，et al. Enhanced induction of cell cycle arrest and apoptosis via the mitochondrial membrane potential disruption in human U87 malignant glioma cells by aloe emodin[J]. J Asian Nat Prod Res，2013，15（9）：1003-1012.

[17] 陶毅明，洪雪，馬義麗，等. 蘆薈大黃素聯(lián)用順鉑對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（20）：127-130.

[18] 鄭建軍，蔡灃，劉開淵，等. 蘆薈大黃素對大腸癌LOVO細胞自噬、凋亡及遷移的作用研究[J]. 中國醫(yī)師進修雜志，2018，41（2）：144-148.

[19] Wasserman L，Avigad S，Beery E，et a1.The effect of aloe-emodin on the proliferation of a new merkel carcinona cell line[J].Am J Dermatopathol，2002，24（1）：17-22.

[20] Lin ML，LU YC，Su HL，et al. Destabilization of CARP mRNAs by aloe-emodin contributes to caspase-8-mediated p53-independent apoptosis of human carcinoma cells[J].J Cell Biochem，2011，112（4）：1176-1191.

[21] Suboj P，Babykutyy S，Srinivas P，et al.Aloe-emodin induces G2/M cell cycle arrest and apoptosis via activation of caspase-6 in human colon cancer cells[J].Pharmacology，2012，89（1-2）：91-98.

（收稿日期：2018-11-11）