馮云霞，張介眉，謝沛霖，郝建軍，朱 旭

(武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院 430000)

血脂異常與心腦血管疾病密切相關，是冠心病和缺血性腦卒中獨立危險因素，血脂異常已成為影響我國人群健康的重要公共衛(wèi)生問題[1]。本課題組歷時十余年開發(fā)研制的蔥白提取物[2-4]，將“通陽”藥物蔥白冷凍干燥后，通過超臨界二氧化碳萃取技術制備而成。該制劑(博心通軟膠囊)于2009年獲得湖北省藥監(jiān)局院內制劑批號(鄂藥制字Z20093124Z)。在本院臨床廣泛應用，在調節(jié)血脂方面療效顯著，本文擬利用基因芯片技術探討蔥白提取物調節(jié)血脂的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 16只雄性SPF級SD大鼠(180±20)g，購自湖北省動物實驗研究中心，合格證號：42000600000069，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。隨機分為模型組、蔥白提取物組，每組8只。

1.1.2建立高脂血癥模型 采用邱服斌等[5]的方法用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)6周，確認形成高脂血癥模型后再檢測其他相關指標。高脂飼料配方：82.3%基礎飼料添加10%的豬油，2%膽固醇，5%蔗糖，0.5%脫氧膽酸鈉，0.2%甲硫氧嘧啶。由北京華阜康生物科技股份有限公司生產提供。

1.1.3藥物及給藥 蔥白提取物由武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑中心提供。根據人動物換算劑量，蔥白提取物組給予42 mg/kg蔥白提取物灌胃，模型組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃，每天1次，均連續(xù)給藥6周。

1.1.4觀察指標 利用基因芯片技術研究蔥白提取物對血脂的調控基因。

1.1.5儀器與試劑 OneArray?大鼠表達譜芯片(臺灣華聯生物科技，226-2013070101)；GCOS(數據處理軟件)；RNeasy Mini Kit(Qiagen 74104)；TRIzol Reagent(Invitrogen，5596-018)；RNAlater(Qiagen，76106)；One-Cycle cDNA Synthesis Kit(Affymetrix，900454)；GeneChip Eukaryotic(Affymetrix，900454)；β-Mercaptoethanol(Calbiochem，444203)

1.2方法

1.2.1提取純化總RNA及cDNA、標記、雜交 用TRIzol按照試劑盒說明抽提總RNA并進行濃度測定。純化采用QIAGEN RNeasy@Kit，純化后做進一步的RNA質量檢測。取2 μL Poly-A RNA Control Stock，稀釋，加入T7-(d7)24 primer 50 μmol/L，2 μL、 5×First strand cDNA buffer、SuperScript Ⅱ溫浴，離心，加 2 μL 10 U/μL T4 DNA 聚合酶，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)終止反應。在合成的雙鏈 cDNA產物中加入 600 μL cDNA Binding Buffer，QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit 純化生物素標記的cRNA。cRNA質控用分光光度計分析。片斷化 cRNA，芯片使用前需平衡至室溫。確定芯片的類型(Standard Array)。在新的1.5 mL RNase-free離心管中配制雜交液。雜交液先99 ℃，5 min，然后45 ℃，5 min。在進行上述步驟的同時通過加樣孔加入適量體積1×雜交緩沖液濕潤芯片。雜交爐中45 ℃，60 rpm預雜交芯片10 min。從芯片中取出雜交緩沖液，加等體積處理好的雜交液。雜交爐中 45 ℃，60 rpm雜交芯片16 h。

1.2.2洗脫、染色、掃描芯片 洗脫、染色、掃描芯片之前都必須先定義一個Experiment。基因芯片洗滌工作站450用來洗脫和染色探針陣列。洗脫和染色、掃描。關閉洗滌工作站。

1.2.3質控標準 同一樣品雜交同一種類兩張芯片時，兩張芯片上除控制點以外，所有信號點的強度經normalize以后的相關性大于95%。陣列圖像：陣列上沒有人為的痕跡，沒有大于芯片面積2.5%的刮痕。平均雜交背景信號值不大于100。B2寡核苷酸探針的特性描述如下：(1)在雜交矩陣的邊緣處亮度為交替出現型；(2)每個拐角處圖案為棋盤形圖案；(3)陣列的名稱位于陣列左上方

雜交控制：雜交信號中，BioB作為代表，其檢出率應該至少有50%；BioC，BioD和cre的信號值應比BioB的信號強。內控制基因：rpt文件中所列的芯片上的看家基因(House keeping controls)，其中至少一個基因3′端的探針集合的雜交信號不能超過其5′端的探針集合的雜交信號的3倍(兩輪放大的除外)。

1.2.4實時熒光定量PCR技術驗證相關基因 Trizol提取組織RNA，逆轉錄成cDNA。反應體系：GAPDH：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30個循環(huán)，72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。Fgf21：第1個循環(huán) ：50 ℃ 2 min 95 ℃ 10 min，40個循環(huán)95 ℃ 30 s 60 ℃ 30 s，Scap：第1個循環(huán)50 ℃ 2 min 95 ℃ 10 min，40個循環(huán)95 ℃ 30 s 60 ℃ 30 s，熒光檢測，并繪制熔解曲線和擴增曲線。驗證基因及引物序列見表1。

1.3數據處理 首先對原始數據進行預處理和均一化處理。沒有重復的數據采用倍數法和Z值法相結合的方法來進行差異基因的篩選，再對其他基因進行差異表達篩選和聚類分析。用Gene Ontology(GO)功能分類標準對差異基因進行功能分類分析。用Pathway分析對差異表達基因進行生物信號通路分析。

2 結 果

2.1RNA質量監(jiān)控 見表2。

2.2差異基因的篩選分析

2.2.1差異表達基因的聚類分析 模型組和蔥白提取物組基因芯片檢測數據標化后，根據差異倍數(fold change)篩選差異表達基因，選擇標準如下：(1)LOG2|差異倍數|≥1和P<0.05(2)LOG2比率=“NA”和樣品強度兩者之間的差異≥1 000；列出的蔥白提取物與模型組差異表達基因以≥Ratio值2倍標準篩選。篩選出表達上調2倍以上并有統計學意義的差異基因59個，其中表達上調的基因16個，表達下調的基因43個。

表3 模型組和蔥白提取物組差異表達基因列表

續(xù)表3 模型組和蔥白提取物組差異表達基因列表

2.2.2差異表達基因的GO分析和Pathway分析 根據KEGG數據庫，利用DAVID數據庫的注釋功能對差異性的表達基因進行注釋及GO分析，對靶基因整合后進行顯著性Pathway分析，結果顯示肉堿棕櫚酰轉移酶1B(carnitine palmitoyltransferase 1b，muscle，Cpt1b)、誘導細胞死亡DNA片斷化因子a樣效應因子A(cell death-inducing DFFA-like effector a，Cidea)、載脂蛋白2(lipocalin 2，Lcn2)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-coenzyme Adesaturase，Scd)、成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，Fgf21)等可能在蔥白提取物調節(jié)血脂異常方面發(fā)揮了重要作用，蔥白調節(jié)血脂異常的導致差異表達的基因集中在能量代謝方面。而其他基因在血脂異常及其調節(jié)的研究方面罕見報道，也提示深入研究它們在血脂異常中的作用具有一定的空間。

圖1 各組探針表達差異倍數統計圖

2.3實時熒光定量PCR驗證結果 挑選相關基因Fgf21和非相關基因Scap去做RT-PCR驗證，結果表明和芯片結果一致。

2.3.1各組大鼠肝組織Fgf21的表達 蔥白提取物調節(jié)血脂的機制可能與上調Fgf21的表達有關。

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內參

圖2各組GAPDHRNA凝膠電泳圖

與模型組相比，蔥白提取物可以明顯上調Fgf21的表達(0.44±0.01vs. 0.65±0.01，P<0.05)，與基因芯片結果一致。

2.3.2各組大鼠肝組織Scap的表達 與模型組相比，蔥白提取物雖然可以減少Scap的表達，但差異無統計學意義(1.70±0.15vs. 1.41±0.13)。基因芯片結果顯示蔥白提取物對Scap的表達影響不大，二者結果一致。蔥白提取物調節(jié)血脂的機制可能與減少Scap的表達關系不大。

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內參

圖3各組Fgf21RNA凝膠電泳圖

1:蔥白提取物組；2:模型組；3:內參

圖4各組ScapRNA凝膠電泳圖

與模型組相比，蔥白提取物雖然可以減少Scap的表達，但沒有統計學意義(1.70±0.15vs. 1.41±0.13)。基因芯片結果顯示蔥白提取物對Scap的表達影響不大，二者結果一致。蔥白提取物調節(jié)血脂的機制可能與減少Scap的表達關系不大。

3 討 論

蔥白提取物與高脂血癥基因間存在著一定的關系，基因芯片為高通量篩選技術，可以將蔥白提取物和基因有效地結合起來，從而為探討蔥白提取物通過何種途徑發(fā)揮辛溫通陽調節(jié)血脂代謝作用機制提供可能。

血脂是血清中的膽固醇、TG 和類脂(如磷脂)等的總稱，TG主要存在于人體的脂肪組織中，食物攝取的外源性TG經胰脂肪酶水解后由腸道吸收，肝臟中內源性TG的合成由底物供給(游離脂肪酸的可用性)、能量平衡(肝糖原的儲存水平)和激素狀態(tài)(胰島素與胰高血糖素之間的平衡)所調節(jié)。本研究結果顯示蔥白提取物調節(jié)TG主要通過以下幾個方面：一方面通過調節(jié)相關信號通路影響脂肪酸轉運降低TG，如Cpt1b是長鏈脂肪酸進入線粒體進行β氧化的限速酶，Scd是催化飽和脂肪酸第9位碳鏈形成n-9系單不飽和脂肪酸的關鍵酶。Scd上升，抑制Cpt1b的活性，影響脂肪酸轉運進入線粒體，使已進入細胞的脂肪酸及其活化產物脂酰輔酶A沉積在胞質內，在線粒體的外膜外難以順暢地進入線粒體基質中進行β氧化以實現最終的能量生成，從而加劇大量脂質堆積。而蔥白提取物可以減少Scd的表達的同時，使Cpt1b的表達上調，促進脂肪酸轉運及其活化產物脂酰輔酶A進入線粒體基質中進行β氧化，生成能量，減輕脂質的沉積[6]。

另一方面通過影響脂肪轉化降低TG。Fgf21主要來源于肝臟，其過表達可促進游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)轉化為酮體，三酰甘油水平下降[7]。脂肪組織按形態(tài)和功能分為兩種形式：白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)。WAT儲存能量，BAT則可加快體內代謝，促進能量消耗。Cidea 在棕色脂肪組織的線粒體中呈高表達，肥胖者脂肪組織中Cidea基因的mRNA表達水平降低，在體重減輕后可以恢復正常[8-9]。而在白色脂肪組織中Lcn2表達顯著增加，在前脂肪細胞分化成熟為脂肪細胞時Lcn2表達急劇增加[10-12]。而蔥白提取物調節(jié)血脂的機制可能與上調Fgf21、Cidea的表達，增加脂肪的利用、消耗及轉運，同時下調Lcn2的表達減少前脂肪細胞分化為脂肪細胞，使脂肪貯存量下降，循環(huán)中的游離脂肪酸及甘油三酯減少[13]。

另外，本課題組前期數據挖掘[14-15]發(fā)現，蔥白提取物具有良好的辛溫通陽作用和降低TG作用，而高脂血癥動物模型中，筆者發(fā)現能量代謝相關基因表達出現明顯變化，如Fgf21、Cpt1b、Cidea、Lcn2、Scd等基因的表達異常，而辛溫通陽中藥蔥白提取物可以調節(jié)這種表達異常，說明辛溫通陽的分子機制可能與能量代謝相關。

本研究采用高通量芯片技術對蔥白提取物辛溫通陽作用及調血脂作用進行評價?？紤]到數據有可能存在假陽性，本課題組在后期進行了特征基因的RT-PCR驗證，結果具有一致性，證明本研究結果可靠。研究結果不僅揭示蔥白提取物調節(jié)血脂的作用機制可能與上調Fgf21、Cpt1b、Cidea，下調Lcn2、Scd基因的表達有關。而且提示了蔥白提取物辛溫通陽作用與能量代謝之間的關系。這為后續(xù)探討蔥白提取物辛溫通陽作用的分子機制提供了思路。