楊敬林，張立成，廖健程，丁 鑫，程 哲，羅東城

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350013；3.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

【研究意義】土傳病菌是土壤中一類對(duì)作物有致病害作用的微生物，該類微生物由土壤傳染至作物從而引起作物發(fā)病被稱之為土傳病菌[1]。引起作物土傳病害的病原物種類很多，包括真菌、細(xì)菌、線蟲和放線菌等，主要為真菌類微生物[2]。這些病原物能在土壤中快速繁殖生長(zhǎng)，當(dāng)土壤中病原微生物較多時(shí)，其通過作物根系侵入植株體內(nèi)。立枯絲核菌是水稻連作土壤中常見的一類土傳病菌，不同作物之間的輪作栽培可以有效減輕這類土傳病的致病害作用[3]。利用自然環(huán)境中對(duì)土壤病原菌具有抗生、營養(yǎng)和競(jìng)爭(zhēng)作用的微生物菌株進(jìn)行作物病害的生物防治的重要措施。拮抗微生物具有抑菌效果穩(wěn)定和抑菌機(jī)理多樣性特征，篩選和鑒定出拮抗病菌功能的微生物菌株在植物病害生物防治中發(fā)揮著重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土傳病害常發(fā)生在作物連作栽培之后，例如，西瓜連作栽培易發(fā)生枯萎病，小麥連作栽培后土傳花葉病指數(shù)增加[4-5]。而通過輪作栽培可有效減輕作物的土傳病害作用，劉星以馬鈴薯—玉米輪作和馬鈴薯連作栽培進(jìn)行比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)連作土壤中對(duì)馬鈴薯具有致病作用的鐮刀菌屬類微生物相比輪作土壤的數(shù)量顯著增加[6]。連作栽培對(duì)根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響是導(dǎo)致連作障礙的一個(gè)重要因素。Lang等人在棉花上的研究證明連作條件下微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土傳病害發(fā)生存在直接關(guān)系[7]。輪作可以減少土傳病害影響，在多類作物栽培實(shí)踐中得以驗(yàn)證。目前對(duì)于輪作減輕土傳病害的機(jī)理尚不完全清楚，一般認(rèn)為輪作維持土壤微生物多樣性平衡，控制土傳病菌的數(shù)量，也有學(xué)者指出輪作能夠降低土傳病菌在土壤中的富集[8-9]。輪作栽培后土壤中存在與土傳病菌相拮抗的微生物是土壤微生物多樣性平衡理論之一[10]。土壤為微生物生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境條件及養(yǎng)分資源，不同種類微生物為維持微生態(tài)系統(tǒng)平衡存在著相互拮抗作用[11]。相關(guān)學(xué)者在作物病害的生物防治研究中發(fā)現(xiàn)水稻連作易使其感染紋枯病，一種由立枯絲核菌引起的病害，而水稻和其它類別的作物輪作栽培則能減少紋枯病菌染病指數(shù)[12-13]?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】我國南方地區(qū)多年的水稻—油菜輪實(shí)踐生產(chǎn)上，該種植方式下作物生長(zhǎng)良好，作物發(fā)生土傳病害的染病指數(shù)較低。水稻—油菜輪作是一種水旱輪作方式，輪作后根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征不同[14]。利用植株上附生或根際土壤中的拮抗細(xì)菌調(diào)控有害微生物的平衡，是有效防控土傳病的生物防治途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用長(zhǎng)期水稻-油菜輪作土壤中篩選出拮抗立枯絲核菌的有益微生物菌株及其拮抗細(xì)菌生理特征和分類進(jìn)行鑒定，通過本研究以期為水旱輪作栽培生物防治土傳病害提供理論上的參考作用和菌株資源。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌株和培養(yǎng)基

供試病原菌：立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。該培養(yǎng)基用于培養(yǎng)土壤分離細(xì)菌類微生物。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。該培養(yǎng)基用于培養(yǎng)病原真菌微生物。

圖1 安仁縣渡口鄉(xiāng)定位試驗(yàn)田輪作和連作分區(qū)Fig.1 Lactation test field of rotation and continuous partition in Dukou village, Anren country

1.2 水稻-油菜輪作土壤微生物菌株的分離

試驗(yàn)采集土壤來自于湖南省安仁縣渡口鄉(xiāng)(26°17′N、113°27′E)，長(zhǎng)期(30年)進(jìn)行水稻—油菜輪作的定位實(shí)驗(yàn)田。試驗(yàn)小區(qū)布置于圖1所示，左邊3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)為“稻-稻”連作，右邊3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)為“稻-稻-油”輪作 。將采集的新鮮土壤樣品用滅菌勺挖取一小勺放入裝有100 mL滅菌水的三角瓶中振蕩均勻，再從中吸取液體稀釋至10-6倍，最后吸取稀釋液0.1 mL均勻涂布在NA培養(yǎng)基上置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)完成后從平板中挑取不同類型的菌落在斜面上劃線純化保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 立枯絲核菌拮抗菌的篩選

拮抗菌的粗篩：將立枯絲核菌病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面菌群分生孢子，再通過無菌棉過濾配制成孢子懸液。取100 μl立枯絲核菌的孢子懸液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，靜置培養(yǎng)24 h后用滅菌竹簽挑取“稻-油”輪作土壤分離的菌株進(jìn)行接種。接種完成后，將PDA平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后觀察菌落特征并測(cè)定接種分離菌株產(chǎn)生的抑菌圈大小。

拮抗菌的復(fù)篩：篩選出具有明顯抑菌效果的菌株，采用平板對(duì)峙法對(duì)拮抗立枯絲核菌進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)拮抗效果較好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)鑒定。

1.4 菌株鑒別

試驗(yàn)采用細(xì)菌培養(yǎng)基分離土壤微生物菌株，對(duì)分離出的拮抗病菌采用試劑盒法提取出DNA后再用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1.4 kb。引物序列F: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，R: 5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’。引擴(kuò)增程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 40 s，65 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)， 最后72 ℃延伸8 min。引物合成和測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似序列選用Blast方式進(jìn)行片段相似性比對(duì)。用 DNAMAN 軟件將供試菌株的核糖體 16S rDNA序列與 GenBank 中的相關(guān)菌株進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

土壤篩分出的微生物菌株生理生化指標(biāo)測(cè)定方法參照咸洪泉[15]編寫的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻—油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌初篩

應(yīng)用稀釋涂平板法從水稻—油菜輪作實(shí)驗(yàn)田土壤樣品中分離出77株菌，分別編號(hào)為1～77#。接種菌株后初步篩選出能在培養(yǎng)立枯絲核菌平板上產(chǎn)生菌圈直徑4 mm以上的菌株有21株，各菌株的菌圈直徑大小如圖2所示。應(yīng)用平板對(duì)峙法進(jìn)行復(fù)篩出對(duì)立枯絲核菌產(chǎn)生顯著拮抗作用的菌株有4株，菌株編號(hào)分別為4#、31#、36#、52#。

2.2 水稻-油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌的分子生物學(xué)鑒定

將 4株明顯具有拮抗立枯絲核菌的菌株進(jìn)行16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增，然后純化擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)其測(cè)序。通過對(duì)菌株P(guān)CR產(chǎn)物DNA片段序列的測(cè)定，4株抗土傳病菌株序列長(zhǎng)度相近，約為600 bp，但是組成DNA的堿基序列不同。把這些DNA片段測(cè)序結(jié)果輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)。應(yīng)用Mega軟件將NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，所構(gòu)建拮抗菌種屬關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(N-J鄰接法)如圖3 所示。從該系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出36#菌株和52#菌株構(gòu)成一個(gè)小分支屬于一類微生物，4#菌株和31#菌株構(gòu)成另一個(gè)小分支屬于一類微生物。36#、52#菌株與已鑒定出的菌株Bacillussubtilisstrain(枯草芽胞桿菌株)(登陸號(hào)：KX950669.1)和Bacillusvietnamensisstrain V21.33(越南芽胞桿菌種)(登陸號(hào)：KT720293.1)的種屬關(guān)系相近。4#、31#菌株與已鑒定出的菌株Bacillussp. oxC partial(芽胞桿菌oxC部分序列)(登陸號(hào)：AJ697957.1)和UnculturedBacillussp. clone TOPO1(芽胞桿菌的克隆培養(yǎng)TOPO1序列)的種屬關(guān)系相近。運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)一步分析，得出36#和52#菌株的同源性達(dá)97.8 %，因此可以認(rèn)為從土壤中篩分出的兩株抗土傳病菌屬于同種微生物。相同的分析方法得出4#和31#菌株的同源性達(dá)98.5 %，這2株抗土傳病菌株也屬同種微生物。系統(tǒng)發(fā)育樹并沒有將4株待鑒定微生物菌株與已知菌株單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支，根據(jù)發(fā)育樹分支的相近性，可初步鑒定出36#和52#菌株屬枯草芽胞桿菌種，4#和31#菌株屬芽胞桿菌屬類微生物未鑒別種。

圖2 “稻-油”輪作土壤篩分的拮抗立枯絲核菌Fig.2 The isolated antagonistic Rhizoctonia solani of soil under rice-rape rotation

2.3 水稻-油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

篩選的4株菌株經(jīng)革蘭式染色均呈陽性，其中4#和31#菌株所形成的菌落表面凸起邊緣光滑，菌落中心處為白色，四周為淡黃色，邊緣不規(guī)則。通過顯微鏡觀測(cè)4株菌的細(xì)胞呈直或彎曲桿狀，有鞭毛，無莢膜。從菌落特征和革蘭式染色觀察4株菌無明顯差異特征，說明這4株菌具有較高的相似性，其特征與芽胞桿菌屬微生物的形態(tài)學(xué)特征相符。

如表1所示，其中4#和31#菌株的生理生化功能特性相同，36#和52#菌株生理生化功能特性相同。這和前面的分子生物學(xué)分類結(jié)果相同，表明4#菌株和31#菌株是同一種菌株，36#菌株和52#菌株是同一種菌株。4#菌株和31#菌株的吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陰性，其余指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果為陽性。36#菌株和52#菌株的V-P試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為陰性，其余指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果為陽性。4株菌株在鹽度小于8 %條件下均能正常生長(zhǎng)，鹽度大于12 %時(shí)生長(zhǎng)受限。根據(jù)4#菌株和31#菌株的生理生態(tài)特性鑒定可鑒定為彎曲芽胞桿菌，36#菌株和52#菌株的生理生態(tài)特性鑒定可鑒定為枯草芽胞桿菌。

3 討 論

水稻和油菜輪作栽培是我國南方地區(qū)常見的一種栽培方式，已有研究報(bào)道長(zhǎng)期的輪作對(duì)土壤微生物群落特征有顯著的影響[16-17]。本研究是根據(jù)微生物之間存在不同菌類的相互拮抗作用這一理論從水稻-油菜輪作土壤中篩選出拮抗立枯絲核菌的有益微生物菌株，并對(duì)菌株種屬類別進(jìn)行鑒定。土壤中微生物種類非常豐富，既有對(duì)作物產(chǎn)生有利作用的促生長(zhǎng)菌也有對(duì)作物有害的致病菌[18]。立枯絲核菌屬于真菌類微生物，其對(duì)多種作物產(chǎn)生危害作用，尤其對(duì)水稻的致病作用較強(qiáng)，其致病機(jī)理是該病菌可以產(chǎn)生內(nèi)毒素，抑制植物細(xì)胞的生長(zhǎng)或使細(xì)胞過早死亡[19]。目前對(duì)該類病的防治主要是通過化學(xué)殺菌劑將病菌殺死，但化學(xué)殺菌劑除了殺滅病菌外，自身也會(huì)殘留在土壤中被作物吸收利用后將影響農(nóng)作物品質(zhì)安全[20]。而生物防治是一種對(duì)環(huán)境友好，有效減少作物土傳病害的方法。生物防治的基本特點(diǎn)是在土壤中形成一定數(shù)量的抗病菌類微生物，以優(yōu)勢(shì)菌種在土壤中生存進(jìn)而抑制有害病菌在土壤中的積累[21-22]。水稻—油菜輪作栽培下作物根際圈存在不同種類的微生物與根系之間的交互作用，微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨栽種物不同而發(fā)生變化[23]。連作土壤中由于單一作物根系與土壤微生物交互作用，微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有害病菌容易積累，當(dāng)其數(shù)量在土壤微生物中達(dá)到一定比例時(shí)則會(huì)引發(fā)作物土傳病菌[24]。輪作后不同作物的根系分泌物有益于自身作物根際圈微生物的生長(zhǎng)，而對(duì)別的作物根際圈微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生拮抗作用[25]。本試驗(yàn)雖然已鑒別出水稻—油菜輪作土壤中存在彎曲芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌兩類具有抗立枯絲核菌的有益菌株，但對(duì)于有益菌株與有害菌株之間的拮抗作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

圖3 拮抗立枯絲核菌分子生物學(xué)的種屬鑒定Fig.3 Species identification by molecular biology for soil borne pathogens

表1 抗土傳病菌株生理生化鑒定結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究是從長(zhǎng)期水稻—油菜輪作試驗(yàn)田采集土壤樣品，篩分具有拮抗立枯絲核菌的微生物菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有4株明顯具有拮抗立枯絲核菌的微生物菌株，經(jīng)過分子生物學(xué)和生理生態(tài)鑒定，這些菌株均為芽胞桿菌屬，其中2株為彎曲芽胞桿菌，另外2株為枯草芽胞桿菌。