王 幸，許妍妍，楊珅珅，王玉明，李遇伯

（天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617）

近年來，中藥的安全和療效日益受到國際的廣泛關注。然而由于中藥化學成分和人體的復雜性，導致其功效機制研究面臨困境[1]，有關“中藥功效與物質基礎科學內涵的內在關聯(lián)機制”的報道較少。這主要是由于中藥功效存在兩個關鍵問題：一是功效評價缺少進程效應指標，無法明確中藥在體內發(fā)揮功效的成分；二是功效產(chǎn)生的始動因素不清楚，其與最終功效效應的相關性仍需進一步探討。因此，本研究借助經(jīng)濟合作與發(fā)展組織提出的有害結局路徑（A OP）概念框架[2]，提出功效結局路徑（PO P），從3個關鍵要素——功效分子起始事件（始動因素）、功效關鍵事件（功效進程拐點）以及功效結局出發(fā)，綜合借助各項新技術，建立中藥功效進程動態(tài)機制的新方法。采取“top-down”策略，從功效結局開始，逐級確定低層次功效關鍵事件并與特定功效分子起始事件相關聯(lián)。本研究將為祛風濕類中藥功效與物質基礎研究提出一項新的適宜模塊化方法。

1 基于結局路徑的中藥功效與物質基礎研究思路

1.1 中藥功效與物質基礎研究近況 中藥是在中醫(yī)藥理論指導下應用的一類藥物，具有多成分、多靶點、系統(tǒng)調節(jié)的特點。目前，中藥的安全和療效日益受到國際的廣泛關注，而其所含化學成分種類繁多、結構復雜，功效與物質基礎不明確，使其在國際發(fā)展中受阻[3-7]。中藥質量標準決定著其安全性和有效性，而中藥的功效與物質基礎是中藥質量控制的重要依據(jù)[7-8]。因此，明確中藥的功效與物質基礎對中藥的現(xiàn)代化和國際化發(fā)展意義重大[9-10]。目前，中藥功效與物質基礎的研究方法主要包括：體內活性追蹤法、中藥譜效關聯(lián)研究法、體外細胞膜色譜法、中藥代謝組學、蛋白質組學和基因組學研究技術，以及化學生物學技術、點擊化學技術與分子對接技術等[11-12]。

體內活性追蹤法是基于中藥化學理論與方法，通過辨識有效部位群，從而追蹤與其結合的藥效物質基礎的方法，姜雪萍[13]采用活性追蹤法研究水蘇乙醇提取物有效部位的抗氧化活性，并追蹤了水蘇抗氧化活性的藥效物質基礎，但只是初步篩選了中藥的功效成分，忽略了其藥效與化學成分間的相互作用。中藥譜效關聯(lián)研究法是目前中藥質量控制與物質基礎研究中較為前沿的方法，可關聯(lián)中藥指紋圖譜中各種化學成分的變化和中藥的藥效，揭示中藥的主要功效成分，但其結果往往易受中藥指紋圖譜的穩(wěn)定性、數(shù)據(jù)分析方法等因素的影響，亦存在許多問題[14-15]。體外細胞膜色譜法是一種可以在體外實現(xiàn)藥物體內過程的生物色譜技術，其作為一種新興技術，可將色譜分離與活性成分篩選相結合，適用于中藥藥效物質基礎的研究，但其在闡明潛在活性成分的作用靶點上遇到瓶頸[16-18]。代謝組學是在高通量、高分辨率和高靈敏度的代謝分析平臺基礎上，通過高分辨質譜等分析技術，采用多元統(tǒng)計分析方法全面分析生物樣品中的所有內源性小分子代謝物，尋找并篩選和疾病相關的特異性代謝標志物，分析其代謝途徑，利于闡明中藥藥效物質基礎及疾病的發(fā)病機制[19-21]。蛋白質組學可基于二維電泳等技術與生物信息學工具，從蛋白質水平上對蛋白質的作用模式、功能機制等進行探索，研究特定條件下的蛋白質整體水平的存在狀態(tài)與活動規(guī)律，能將復雜的中藥功效成分和蛋白質的表達、修飾有機聯(lián)系起來[22-23]，篩選任何有意義的中藥功效成分，揭示機體對它的反應途徑、進程與本質，從而闡明中藥的藥效物質基礎和作用機制[24-26]?；蚪M學可從分子水平、基因水平研究中藥在基因組上的作用靶點、作用規(guī)律以及中藥活性成分的片段基因，利于發(fā)掘中藥藥效物質基礎[27]。化學生物學在靶點發(fā)現(xiàn)策略包括化學探針和藥物的開發(fā)中都起到了關鍵作用，系統(tǒng)化學生物學可逆向篩選中藥中的有效成分[28]。點擊化學技術現(xiàn)已成為當前的一大研究熱點，主要是通過小單元的拼接，快速準確地完成形形色色分子的化學合成。如Ma等[29]論述了點擊化學技術在拓撲異構酶Ⅱ抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿?、蛋白酪氨酸激酶抑制劑及抗菌藥物在抗癌藥物合成中的應用。分子對接技術可對化學成分與直接靶標的結合模式進行預測[30-31]，之后通過代謝組學、蛋白質組學等技術與“核心靶標”進行互作分析，可發(fā)現(xiàn)與核心靶標直接作用的功效成分。

中藥藥效物質基礎研究是一個系統(tǒng)工程，有必要采用多學科交叉等方式，開拓思路，靈活運用以上技術，各有側重地發(fā)揮其優(yōu)勢，才可利于系統(tǒng)地闡釋中藥功效與物質基礎的關聯(lián)性，為中藥質量控制提供理論依據(jù)。

1.2 中藥功效分子起始事件——中藥功效關鍵事件——中藥功效結局概念框架的提出 AOP概念框架是用以概述已有的關于直接分子起始事件（如：外源化合物與特定生物大分子的結合）與在生物不同組織結構層次（如：細胞、器官等）所出現(xiàn)的與危險度評定（如生存、發(fā)育等）相關的“有害結局”之間相互聯(lián)系的一個概念框架。它是一個可跨越多種生物結構層次的一系列連續(xù)事件的生物組織，能連接起始事件與結局之間的內容，不同的構成主要取決于產(chǎn)生AOP或所關注危險度內容（如：生存、發(fā)育等）的類型以及生物學信息的范圍。AOP的概念內涵包含了起點到終點，即分子起始事件到有害結局的全部過程，能夠判定關鍵的不確定性和需要優(yōu)先研究的內容[32-34]。依此，提出POP概念框架，即POP3個關鍵要素——功效分子起始事件（始動因素）、功效關鍵事件（功效進程拐點）及功效結局。

功效分子起始事件（始動因素）即基于分子水平的中藥功效結局的起始事件，其是開始中藥功效結局路徑時化學物與機體發(fā)生生化反應的一個關鍵起始位置，從而引起的一系列更高效應水平的事件[35-36]。功效關鍵事件（功效進程拐點）是連接中藥功效分子起始事件與中藥功效結局之間的多個層次生物組織上的有因果關系或某種相關關系的事件。即中藥在發(fā)揮功效的過程中，在一些中藥功效成分的作用下，疾病開始向著治療目的演變發(fā)展，這個時期稱為關鍵時期，在達此拐點時期前，停止用藥后會導致治療不徹底等現(xiàn)象[36-37]。中藥功效結局是在與一系列效應水平事件相關聯(lián)的特定度內容基礎上，用以判定關鍵的不確定性和需要優(yōu)先研究的內容[38]。因此，本研究旨在通過中藥功效結局、中藥功效關鍵事件和中藥功效分子起始事件3個關鍵因素，系統(tǒng)地闡釋中藥功效與物質基礎的內在關聯(lián)機制研究，建立中藥功效進程，從而明確中藥的功效與物質基礎。

2 以祛風濕類中藥為例，建立中藥功效進程動態(tài)機制的新方法

中醫(yī)將祛風寒濕邪治療風濕痹證為主的藥物稱為祛風濕藥，其功效主治廣泛[39]。臨床上，風濕類疾病包括：類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、痛風等百余種疾病，這些疾病多是慢性的難治性疾病，發(fā)病機制也尚未完全清楚，其病情反復、臟器受累等成為風濕患者的困擾。但不同疾病的臨床特點各有不同，即使同一疾病也會因病情的嚴重程度、累及臟腑、用藥反應等各有差異，且患者的體質、性別、地域等亦不同。因此，臨床醫(yī)生在深刻了解患者病情的同時，須綜合考慮各項因素，制定出個體化的診療方案。但個體化的治療方案要求臨床醫(yī)生明確中藥的藥效物質基礎，才可精準用藥，從而利于臨床治療和新藥研發(fā)[40-41]。

文獻顯示，祛風濕類中藥治療類風濕性疾病的功效成分（物質基礎）主要包括：生物堿類、苷類、黃酮類、內酯類、苯丙素類、醛酮類等[42]，研究發(fā)現(xiàn)這些功效成分在臨床上的廣泛應用和治療效果基本是通過動物模型闡明和證實的，實驗方法單一，對祛風濕類中藥的功效與物質基礎研究不深入。有關祛風濕類中藥功效成分的作用機制研究較少，迫使臨床醫(yī)生在治療此類疾病時主要靠西藥維持，出現(xiàn)了藥物不良反應大、患者不耐受等眾多后果，而中藥種類多且不良反應小，可多成分、多靶點綜合治療，有著獨特的優(yōu)勢，因此應從其基因層面、治療靶點等多方面深入研究[42-44]，建立更科學、系統(tǒng)的祛風濕類中藥功效與物質基礎評價體系，以全面闡釋祛風濕類中藥的功效進程、功效產(chǎn)生的始動因素，為中藥質量控制提供依據(jù)，從而更好地服務于臨床。

針對當前祛風濕類中藥的功效與物質基礎研究現(xiàn)狀，本研究根據(jù)POP概念框架，采取“top-down”策略，其是一種”自頂向下”的設計方法，它可由整體到局部，即從中藥功效結局出發(fā)到明確中藥功效成分（物質基礎）的研究過程[45]。所謂“頂（to p）”是指以整體研究思路為基礎，從目標功效結局開始展開研究，即針對不同的風濕性疾病，設置合理的給藥方案，通過觀察相應祛風濕類中藥功效的檢測指標，明確其功效和功效進程，依據(jù)關鍵檢測指標-時量關系圖和關鍵節(jié)點的生理病理特征，確證其功效結局；而“下（d own）”則是指通過各項新技術，逐級確定低層次功效關鍵事件（功效進程拐點）并與特定功效分子起始事件（始動因素）相關聯(lián)[46]，即通過代謝組學、蛋白質組學以及“代謝物-蛋白質”關聯(lián)分析技術，初步發(fā)現(xiàn)祛風濕類中藥的功效進程拐點（功效關鍵事件），而后從基因層面、關鍵靶點等明確祛風濕類中藥功效的關鍵事件和其與功效結局之間的關聯(lián)；隨后在細胞層面篩選祛風濕類中藥關鍵功效成分，應用化學生物學技術考察祛風濕類中藥關鍵功效成分的直接靶標，利用分子對接技術預測其功效成分與直接靶標的作用模式，借助可檢測基因表達等技術，初步發(fā)現(xiàn)“直接靶標-功效關鍵事件-功效結局”的相關性，后通過基因改造技術，反向證實祛風濕類中藥藥效進程中直接靶標與其功效關鍵蛋白及功效結局之間的關聯(lián)性，進一步確證祛風濕類中藥的功效分子起始事件，從而構建完善的祛風濕類中藥功效POP概念框架，建立其功效進程動態(tài)機制的新方法，見圖1。

圖1 技術路線圖

3 展望

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展，中藥的安全和療效問題在國際化發(fā)展中日益突出。當前中藥的功效與物質基礎研究評價指標多為靜態(tài)效應指標，無法反映其功效發(fā)生的動態(tài)過程，且功效的始動因素不清楚。本研究建立了一套“top-down”的“功效結局-功效關鍵事件-功效分子起始事件的祛風濕類中藥功效進程動態(tài)機制研究新策略，且充分考慮了中藥的特殊性，靈活地將化學生物學、分子對接技術和組學技術等相互結合，應用于中藥功效與物質基礎的研究中。本研究以祛風濕類中藥為例，建立其功效POP框架，深刻闡釋其功效機制，為明確中藥的功效與物質基礎研究提供了一項新的適宜模塊化方法。