陳超磊，蘆天罡，倪和民，盛熙暉，王相國(guó)，齊曉龍，邢凱，劉云海，郭勇

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

胚胎休眠現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于一些野生哺乳動(dòng)物中，是指動(dòng)物交配受精后，受精卵發(fā)育至胚泡階段后游離于著床部位，但不立即發(fā)生著床，而是延緩一定時(shí)間后再植入處于容受態(tài)的子宮，繼續(xù)完成其后的著床發(fā)育的現(xiàn)象。由于著床是處于窗口期的胚胎與處于容受態(tài)子宮的相互作用的過程，研究胚胎的休眠現(xiàn)象是研究胚胎著床機(jī)理的重要內(nèi)容之一，并可為輔助生殖技術(shù)提供必要的參考。目前，對(duì)于小鼠休眠胚胎的研究都集中在揭示胚胎休眠現(xiàn)象的分子機(jī)理以及與之相關(guān)的胚胎著床的分子調(diào)控上，例如張劭俁等[1]對(duì)程序化冷凍的小鼠休眠胚胎和正常休眠胚胎進(jìn)行了基因芯片掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在228個(gè)差異表達(dá)基因，其中50個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，178個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，盧文謹(jǐn)?shù)萚2]研究發(fā)現(xiàn)LYZ1 蛋白在休眠模型小鼠胚胎中為抵御外界不利環(huán)境而上調(diào)；劉迪等[3-4]研究發(fā)現(xiàn)C3，Hba-α基因很可能參與了胚胎抗凍過程的相關(guān)調(diào)控等等。但在休眠胚胎應(yīng)用方面的研究較少。小鼠休眠胚胎是一個(gè)很好的研究應(yīng)用模型。當(dāng)前，休眠胚胎盡管可以保存一定的時(shí)間，但非常有限。而實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用則需要能夠長(zhǎng)期保存即冷凍保存，以達(dá)到保存的目的。研究休眠胚胎的冷凍效果是休眠胚胎研究走向應(yīng)用的重要步驟，可為改進(jìn)大家畜的輔助胚胎工程技術(shù)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR系小鼠30只，6 ～ 8周齡，體重25 ～ 30 g；雄鼠8周齡以上，體重30 ～ 35 g，動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京) 2014-0008】， 實(shí)驗(yàn)操作在北京農(nóng)學(xué)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行【SYXK(京) 2015-0004】。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甘油(glycerol)，孕酮(progesterone，P4)，牛血清白蛋白(BSA)，抗羊脾細(xì)胞抗血清(anti-sheep whole serum)，豚鼠補(bǔ)體(guinea pig complement serum)，碘化丙啶(propidium iodide,PI)，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)，bisbenzimide(Hoechst33342)，胚胎冷凍液購(gòu)自ICPbio Reproduction，胎牛血清(FBS)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，葡萄糖、NaCl等無機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 胚胎的獲取

休眠胚胎的獲?。喝焉镄∈笠娝ǖ牡?天上午 9：00 時(shí)摘除雙側(cè)卵巢保留輸卵管，連續(xù)3 d頸部皮下注射 0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，見栓第8天收集休眠胚胎；孵化期胚胎的獲取：于見栓第5天12:00時(shí)沖出受孕母鼠子宮內(nèi)的胚胎。

1.2.2 冷凍方法

將獲取的胚胎先用PBS (pH7.4)清洗兩遍，然后依次用含1/3的冷凍液，1/2的冷凍液，2/3的冷凍液的PBS清洗，隨后在冷凍液中清洗三遍，然后用0.25 mL的塑料細(xì)管按冷凍液(2.5 cm)→空氣(1.0 cm) →冷凍液(2.5 cm)→空氣(1.0 cm)→含有胚胎的冷凍液(3.0 cm)→空氣(1.0 cm)→冷凍液(2.5 cm) → 空氣(1.0 cm)→冷凍液(2.5 cm)制備凍存胚胎細(xì)管。提前在冷凍儀內(nèi)放入液氮, 把裝好的細(xì)管放入程序冷凍儀中，以1℃/min的速度降到-5℃時(shí)，使其在平臺(tái)期平衡10 min，然后迅速取出細(xì)管并在兩端制冰，再平衡10 min。然后以0.3℃/min的速度直至降到-35℃。隨后置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 解凍與培養(yǎng)方法

從液氮中取出冷凍細(xì)管，室溫輕晃動(dòng)8 s左右，置于35℃水中15 s左右取出，用酒精棉處理細(xì)管之后用吸水紙擦干，剪掉細(xì)管兩端，沖出胚胎，按三步脫除甘油法脫去冷凍液。胚胎解凍后分別置于小鼠胚胎培養(yǎng)液小滴中，石蠟油覆蓋，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察和記錄各組胚胎發(fā)育情況，顯微照像記錄。

1.2.4 移植方法

首先將假孕母鼠(正常母鼠與結(jié)扎公鼠交配)麻醉。于背腰側(cè)消毒殺菌后剪開皮層，取出一側(cè)子宮，用眼科鑷子夾住子宮與輸卵管的結(jié)合部使子宮與鼠體成45度角，另一用4號(hào)針頭入子宮腔，上下輕輕移動(dòng)以確認(rèn)針頭未扎入子宮腔內(nèi)壁，迅速沿針眼將移植槍扎入將卵吹入子宮內(nèi)。子宮輕推回小鼠體內(nèi)，進(jìn)行術(shù)后縫和，傷口消毒。注意保溫，觀察并記錄出生情況。

1.2.5 雙重?zé)晒馊旧?/p>

(1) 染料準(zhǔn)備

染料儲(chǔ)液：1 mg染料+1 mL雙蒸水；染料工作液：4 μL染料儲(chǔ)液+10 μL 95%乙醇+36 μL 2.3%檸檬酸鈉。

(2) 雙重?zé)晒馊旧襟E

清洗胚胎：首先用含0.1% PVA的PBS清洗胚胎3次，每次間隔3 min，確保清洗干凈無血清殘留；結(jié)合抗體：將胚胎放入含抗血清的PBS(5 μL抗血清+25 μL PBS)小滴中反應(yīng)30 min，使其充分結(jié)合抗體；隨后將胚胎用含10% FBS的PBS中處理5 min，以便結(jié)束抗體反應(yīng)；清洗胚胎：用含0.1% PVA的PBS清洗3次；結(jié)合補(bǔ)體和染色：將胚胎置于含有補(bǔ)體和兩種染料的PBS(5 μL補(bǔ)體+2 μL PI+2 μL Hoechst 33342+21 μL PBS)小滴中避光反應(yīng)90 min；壓片與觀察：清洗胚胎，洗掉多余染料和雜質(zhì)。吸出胚胎移至事先做好的載玻片微滴，用凡士林支撐4周，蓋玻片壓片，在熒光顯微鏡下觀察，在藍(lán)色濾光片下內(nèi)細(xì)胞團(tuán)呈藍(lán)色，滋養(yǎng)層細(xì)胞呈粉色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胚胎冷凍結(jié)果

從表1中可以看出休眠胚胎的回收率極顯著高于孵化期胚胎(72.1% vs 50.2%，P< 0.01)。各組胚胎冷凍后形態(tài)見圖1,2。

2.2 胚胎凍融后體外復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)

從表2中可以看出休眠胚胎的繼續(xù)發(fā)育率極顯著高于孵化期胚胎(94.2% vs 73.9%，P< 0.01)。各組胚胎培養(yǎng)后形態(tài)見圖3。

組別Groups解凍胚胎數(shù)(枚)No. of thawed embryos回收數(shù)(枚)No. of recovery回收率(%)Recovery rate of embryo形態(tài)完整數(shù)(枚)No. of recovery embryos可用率(%)Available rate of embryo休眠胚胎Dormant embryo36528880.9a26372.1a孵化期胚胎Hatched embryo31923874.6a16050.2b

注：表中同列字母不同表示差異有顯著性(P< 0.05)；字母相同表示差異無顯著性(P>0.05)。(下表同)

Note. Different letters indicate significant differences among them(P< 0.05), the same letters indicate no significant differences among them (P> 0.05).(The same in the following tables)

表2 胚胎凍融培養(yǎng)后發(fā)育率Table 2 Development rates of embryos after frozen-thawing

2.3 胚胎凍融后移植結(jié)果

從表3中可以看出休眠胚胎的產(chǎn)子率顯著高于孵化期胚胎的產(chǎn)仔率(40.8% vs 30.1%，P< 0.05)。

2.4 胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

從表4中可以看出，休眠胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)顯著高于孵化期胚胎的(27.83 vs 19.53，P< 0.05)，兩種胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)無差異。凍融，培養(yǎng)后休眠胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)顯著高于孵化期胚胎的(25.18 vs 14.68，P< 0.05)，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)也顯著高于孵化期胚胎(114.09 vs 73.88，P< 0.05)。凍融，培養(yǎng)前后休眠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)數(shù)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)數(shù)差異均不顯著，培養(yǎng)后孵化期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)都顯著低于冷凍前的。各組胚胎雙重染色照片見圖4。

圖1 小鼠正常胚胎(A)與休眠胚胎(B)(×20)Figure 1 Normal(A) and dormant(B) embryos of mice (×20)

圖3 解凍后培養(yǎng)1 d后的小鼠孵化期胚胎(A)和休眠胚胎(B)(×10)Figure 3 Hatched (A) and dormant(B) embryos at one day after thawing (×10)

圖2 解凍后小鼠孵化(A)和休眠(B)胚胎Figure 2 Hatched (A) and dormant(B) embryos of mice after thawing (×20)

圖4 小鼠孵化胚胎(A)和休眠胚胎(B)雙重染色(×60)Figure 4 Double staining of mouse hatched(A) and dormant(B) embryos(×60)

表3 胚胎凍融后移植產(chǎn)子率Table 3 Procreation rate of mice after embryo transplantation

表4 胚胎凍融前后的細(xì)胞數(shù)Table 4 Number of cells in the embryos before and after freeze-thawing

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物大量的胚胎損失發(fā)生在著床前后，因而胚胎著床一直是研究哺乳動(dòng)物生殖調(diào)控機(jī)理的關(guān)鍵[5-7]。胚胎在發(fā)育過程中受多種激素、生長(zhǎng)因子以及各種酶的影響。20世紀(jì)60年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物為了更好地繁衍生息而進(jìn)化產(chǎn)生胚胎延遲著床現(xiàn)象[8]，胚胎延遲現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及深入研究，不僅有助于人們更為深入的了解胚胎著床過程的分子調(diào)控機(jī)制；同時(shí)，延遲著床模型的廣泛應(yīng)用，也提供了一種新的研究著床窗口,分子網(wǎng)絡(luò)開啟與關(guān)閉的有效手段，對(duì)不孕癥的治療、相關(guān)藥物的開發(fā)及動(dòng)物的繁殖成功率的提高等都有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此針對(duì)哺乳動(dòng)物的休眠胚胎進(jìn)行較廣泛的相關(guān)生物學(xué)研究具有一定的理論意義和潛在應(yīng)用價(jià)值[9-10]。

休眠胚胎和正常孵化期胚胎的回收率均較低，分析其原因可能兩者同時(shí)處于孵化階段沒有透明帶的保護(hù)，在操作過程中很易破碎或黏附在細(xì)管管壁上。Marti等[11]認(rèn)為冷凍對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)及細(xì)胞連接有損害。Tao等[12]認(rèn)為，胚胎骨架可增加胚胎的結(jié)構(gòu)完整性，較好地耐受凍融過程中滲透壓的改變。顧美超等[13]研究表明小鼠休眠胚胎的亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比其正常孵化胚胎更具抗凍性。Hmatani等[14]通過檢測(cè)休眠和激活的胚胎中的2萬個(gè)基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中有229個(gè)基因表達(dá)存在差異。這些基因主要參與細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等通路。從凍融回收胚胎的形態(tài)完整數(shù)和形態(tài)完整率方面來看，休眠胚胎顯然優(yōu)于正常孵化胚胎。分析其原因，可能是較孵化期胚胎休眠胚胎在休眠期間一方面通過積累更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另一方面通過不斷調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)及能量代謝來適應(yīng)外界不利環(huán)境，進(jìn)而能夠較快的恢復(fù)正常形態(tài)并且繼續(xù)發(fā)育。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的小鼠囊胚或孵化囊胚冷凍后移植產(chǎn)仔率在30% ～ 45%之間[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中休眠胚胎的凍融后移植產(chǎn)仔率為40.8%，顯著高于孵化期胚胎的30.1%，說明休眠胚胎經(jīng)過凍融后體內(nèi)發(fā)育潛力要優(yōu)于正常活化胚胎。分析其原因可能與冷凍方法，操作者的胚胎移植技術(shù)方法，凍融的胚胎時(shí)間等等有關(guān)。對(duì)于凍融結(jié)局的影響，除了種屬、冷凍保護(hù)劑和冷凍方法外，胚胎的發(fā)育階段尤為重要。因?yàn)樵谂咛サ牟煌l(fā)育階段，其代謝變化伴隨著細(xì)胞漿和冷凍保護(hù)劑之間的相互作用而變化。因此，不同發(fā)育階段的胚胎對(duì)同一種冷凍方法的作用結(jié)果有一定差別[17]。

從雙重染色結(jié)果來看[18]，休眠胚胎的ICM細(xì)胞數(shù)極顯著高于孵化期胚胎的ICM細(xì)胞數(shù)。而TE細(xì)胞數(shù)則差異不顯著。表明休眠胚胎在延遲著床過程中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)有一個(gè)持續(xù)增殖過程，而滋養(yǎng)層細(xì)胞則處于基本穩(wěn)定。這與Given等[19]的研究結(jié)果一致，其通過測(cè)定小鼠胚胎延遲著床后一定時(shí)間內(nèi)的DNA合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)內(nèi)，ICM細(xì)胞的DNA合成一直處于較高水平，而TE細(xì)胞的DNA合成則在卵巢摘除手術(shù)24 h后有一個(gè)大幅度的降低，并在其后維持在較低水平。由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將會(huì)發(fā)育成胎兒，因而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的定量測(cè)定能夠比較準(zhǔn)確地地預(yù)估囊胚的植入潛能，不斷增大的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)目與胚胎的著床率有一個(gè)近乎線性的增長(zhǎng)關(guān)系，即內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育與其移植后胎兒的發(fā)育能力呈正相關(guān)[20]。而囊胚的直徑和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)與著床率無直接關(guān)系[21]。所以這一結(jié)果可以從一個(gè)側(cè)面說明休眠胚胎在胚胎質(zhì)量上要優(yōu)于孵化期胚胎。

休眠胚胎凍融培養(yǎng)前后的ICM和TE細(xì)胞數(shù)均無差異，而孵化胚胎ICM和TE細(xì)胞數(shù)都顯著高于解凍培養(yǎng)后的相關(guān)值，說明冷凍處理對(duì)孵化期胚胎破壞較大，在染色過程中發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞之間連接較為松散，容易造成丟失，并且在凍融后的培養(yǎng)過程中細(xì)胞恢復(fù)和發(fā)育潛力較休眠胚差。本實(shí)驗(yàn)中休眠胚胎與正常胚胎的ICM/TE比值分別為0.3和0.22，此結(jié)果要小于前人的 0.6，這是因?yàn)榕咛ヌ幱趪财跁r(shí)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)的增加會(huì)減慢并出現(xiàn)一個(gè)凋亡的波峰，結(jié)果是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例會(huì)隨著囊胚的不斷擴(kuò)張、孵化和開始著床而不斷下降[22]。 Vander等[23]發(fā)現(xiàn)小鼠5 d擴(kuò)張囊胚的總細(xì)胞數(shù)與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的比率(ICM/TE)呈負(fù)相關(guān)，以上結(jié)果都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，通過對(duì)小鼠正常孵化胚胎和休眠胚胎凍融后體內(nèi)外發(fā)育潛力的比較，我們發(fā)現(xiàn)休眠胚胎抵御冷凍的能力以及凍融后體外和體內(nèi)發(fā)育潛力均優(yōu)于孵化期胚胎。休眠胚胎的抗凍能力不僅與其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞連接有關(guān)，其中還涉及許多尚不明確的細(xì)胞調(diào)控通路，尚需進(jìn)一步深入研究。