陳小偉，范昊安，張婷，崔艷麗，沙如意，*，毛建衛(wèi)，*

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023；2.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州310027）

咖啡是世界最受歡迎的三大飲品之一，在我國云南省有廣泛種植，其主要品種為云南小粒咖啡?？Х榷贡煌獗砉饣目Х裙ぐ?，成熟的咖啡果皮呈深紅色或紫紅色?？Х裙ぶ懈缓ㄇ嗨豙1]，具有抗氧化[2]、保護(hù)心臟[3]、抑制癌細(xì)胞生長[4]等一系列保健功效。在我國，每年都有大量的咖啡果皮等副產(chǎn)物被丟棄，不僅造成資源的浪費(fèi)，還導(dǎo)致了環(huán)境的污染。

植物酵素最初起源于日本，因其顯著的生理功效受到廣泛關(guān)注，近年來也在中國大陸得到廣泛發(fā)展。植物酵素是以一種或多種蔬菜、水果和豆谷類、海藻類、藥食兩用本草類等為原料，加（或不加）糖類物質(zhì)，經(jīng)加入單種或多種益生菌（或不加菌依靠植物表面的微生物），經(jīng)過低溫長時(shí)間發(fā)酵而產(chǎn)生的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[5-6]。

目前對于植物酵素的研究較多，主要包括發(fā)酵工藝[7]、功能性[8]以及發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物[9]的研究。植物酵素中成分較多，生物化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜，發(fā)酵過程難以確定。目前，關(guān)于不同發(fā)酵時(shí)間段植物酵素的綜合評價(jià)較少，選擇合適的評價(jià)方法確定植物酵素發(fā)酵狀態(tài)尤為關(guān)鍵。本研究對咖啡果皮植物酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的變化以及抗氧化性能進(jìn)行研究，建立了代謝產(chǎn)物與抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性，利用主成分分析評價(jià)不同時(shí)間段咖啡果皮酵素的綜合指標(biāo)，確定咖啡果皮酵素發(fā)酵狀態(tài)，以期建立一種咖啡果皮酵素綜合指標(biāo)變化評價(jià)方法，為咖啡果皮酵素的精確發(fā)酵提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；同時(shí)對咖啡果皮的高效利用，有效的減少資源的浪費(fèi)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

咖啡果：云南省保山市小?？Х?，完全成熟，咖啡果皮呈現(xiàn)深紅色；發(fā)酵用糖液：浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

葡萄糖、蒽酮、硫酸、氫氧化鈉、福林酚（10%）、甲醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；α，α-二苯基-β-苦苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2-聯(lián)氮基-雙-二胺鹽[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS]、考馬斯亮藍(lán)G250：上海長哲生物科技有限公司；乙醇：優(yōu)級純，上海阿拉丁試劑有限公司；醋酸、乳酸：標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

Allegra X-12R 離心機(jī)：貝克曼庫爾特有限公司；PTX-FA210 型電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；XMTD-204 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；Waters e2695 高效液相色譜（配備Waters 2998 二極管陣列紫外檢測器）：Waters 公司；UV-5500 PC 型紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；GC2010/HSS 86.50 島津GC2010 氣相色譜儀+DANI 頂空進(jìn)樣器：日立公司；PHS-3C 酸度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 咖啡果皮酵素的制備

取滅菌、冷卻后的無菌水輕輕沖洗帶果皮咖啡表面，自然瀝干后剝下果皮（保留剝皮過程中的汁水），整個(gè)過程在無菌環(huán)境下進(jìn)行。按咖啡果皮與糖液3∶4（質(zhì)量比）加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中，于（25±5）℃條件下避光發(fā)酵，定期吸取一定量的發(fā)酵液，于6 000 r/min 條件下離心15 min，取上層清液檢測。

1.2.2 總糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法[10]測定咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中總糖含量變化。將樣品稀釋5 000 倍，取稀釋后的發(fā)酵液200 μL 于2 mL 離心管中，在冰浴條件下向試管中加入0.2 g/100 mL 的蒽酮-硫酸溶液800 μL，冷卻后振蕩混勻。以水為空白對照，沸水浴中反應(yīng)10 min 后于冰水浴中再次冷卻，取100 μL 于96 孔板中，于620 nm處測吸光度。并按照10、20、30、40、60、80 μg/mL 配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取200 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 總酸含量和pH 值的測定

參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，在此基礎(chǔ)上有所調(diào)整，取離心后的咖啡果皮酵素1 mL，加水定容至50 mL，取一定體積的上述稀釋液于150 mL錐形瓶中，以0.002 mol/L 的NaOH 水溶液為滴定液，酚酞試劑作為指示劑。發(fā)酵液pH 值的測定依據(jù)GB 10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH 值的測定方法》，取離心后的發(fā)酵液直接檢測。

1.2.4 醋酸和乳酸含量的測定

色譜條件：色譜柱為Agilent TC C18 柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇：KH2PO4緩沖液（pH 2.7）=2∶98（體積比）；流速：1 mL/min；檢測波長210 nm，柱溫25 ℃[11]。

待測樣品制備：取離心好的發(fā)酵液上清液，加入0.01 mol/L KH2PO4緩沖液（pH 2.7）稀釋5 倍，經(jīng)過0.22 μm 微孔濾膜過濾待測。

1.2.5 乙醇含量的測定

以叔丁醇為內(nèi)標(biāo)，采用GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇含量的測定》第三法進(jìn)行測定。

自動(dòng)頂空條件[12]：爐溫85 ℃，平衡時(shí)間40 min；進(jìn)樣閥溫度105 ℃；傳輸線溫度110 ℃。氣相色譜條件：色譜柱：RTX-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃，平衡時(shí)間3.0 min，10 ℃/min 升溫至180 ℃，保溫5 min；進(jìn)樣口/氣化室溫度：200 ℃；分流比30∶1；檢測器溫度250 ℃。

1.2.6 總酚含量的測定

采用福林酚法測定咖啡果皮酵素發(fā)酵液中總酚含量的變化[13]。取10μL 不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液于10mL離心管，加水稀釋至500 μL，加入10%福林酚水溶液（體積比）2.5 mL，充分振蕩混勻，常溫避光靜置3 min。反應(yīng)結(jié)束后加入7.5%Na2CO3水溶液2 mL，振蕩混勻。25 ℃，120 r/min，避光反應(yīng)1 h，以0.5 mL 去離子水按上述方法進(jìn)行空白調(diào)零，765 nm 下測定吸光度。

1.2.7 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G250 法[14]測定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)G250 試劑100 mg，溶于50 mL 95%乙醇，加入85%（磷酸，用水稀釋至1 000 mL備用。利用牛血清白蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程y=0.005 5x+0.064，R2=0.999 4。試驗(yàn)前取離心后的咖啡果皮酵素200 μL，加水稀釋至1 000 μL，然后加入5 mL 配制好的考馬斯亮藍(lán)G250 溶液，混勻，靜置反應(yīng)10 min。以去離子水做空白對照，在595 nm 波長下測定吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.8 DPPH 自由基清除能力的測定[15]

取5 μL 離心后的咖啡果皮酵素于10 mL 潔凈干燥的離心管中，加入去離子水補(bǔ)足至2 mL，再分別加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，25 ℃恒溫水浴30 min，以去離子水調(diào)零，于517 nm 下檢測樣品吸光度。

式中：A0為去離子水為參比溶液的吸光度；A1為樣品吸光度；A2為本底管的吸光度。

1.2.9 ABTS+自由基清除能力的測定[16]

用5 mmol/L 的pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將ABTS 稀釋到7 mmol/L，加入過硫酸鉀溶液，得到最終濃度為2.45 mmol/L ABTS 溶液，在暗處室溫放置12 h～16 h。使用前，在波長734 nm 處，用PBS 緩沖液將ABTS 溶液稀釋至吸光度為0.7±0.02。

分別取4 μL 的離心后的咖啡果皮酵素于10 mL潔凈干燥的離心管中，用上述PBS 溶液補(bǔ)足至300 μL，再加入5 mL 上述稀釋液，30 ℃下反應(yīng)1 h，734 nm 下測吸光度。

式中：A0為去離子水為參比溶液的吸光度；A1為樣品吸光度；A2為本底管的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用excel 2007 和Origin 86 繪制本文圖表，數(shù)據(jù)采集方法利用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）的形式表示。相關(guān)性分析采用SPSS 18.0 處理，采用Duncan 法進(jìn)行多組分樣品間差異顯著性分析，其中不同字母代表差異顯著（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總糖含量的變化

發(fā)酵過程中總糖含量變化見圖1。

在試驗(yàn)過程中，加入的高濃度糖液不僅可以抑制部分雜菌生長，篩選出優(yōu)勢菌群，也為微生物的生長代謝提供碳源和能源。檢測發(fā)酵過程中總糖含量的變化可以較為清晰的掌握微生物對糖類物質(zhì)的利用狀態(tài)，間接地確定發(fā)酵狀態(tài)和終點(diǎn)。本研究以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用蒽酮-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨著葡萄糖濃度的提高，吸光度不斷增大，并呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為：y=0.002 1x-0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。發(fā)酵的前16 d，總糖含量有輕微的上升，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期微生物繁殖較慢，對糖類物質(zhì)的利用不高[17]，原料中的糖類物質(zhì)溶出導(dǎo)致糖含量上升。發(fā)酵16 d后，總糖含量出現(xiàn)明顯下降，說明此時(shí)微生物開始大量利用糖類物質(zhì)進(jìn)行生長代謝。楊小幸等[18]對蔗糖為碳源發(fā)酵制備的蘋果酵素發(fā)酵過程中的蔗糖、果糖和葡萄糖進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過20 d 的發(fā)酵，蔗糖幾乎全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，但總含量有明顯下降。

圖1 發(fā)酵過程中總糖含量變化Fig.1 Changes in concentration of total sugar during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中總酸含量和pH值的變化

圖2為咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中總酸含量變化和pH 值的變化圖。

圖2 發(fā)酵過程中總酸含量與pH值變化Fig.2 Changes in pH value，total titratable acidity during fermentation

酸度是衡量酵素成熟度的主要指標(biāo)之一，pH 值是衡量發(fā)酵過程是否正常的關(guān)鍵條件?？Х裙ぶ兴嵝晕镔|(zhì)溶出和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物都會(huì)導(dǎo)致咖啡果皮酵素總酸和pH 值的變化?？Х戎懈缓喾N有機(jī)酸類物質(zhì)，不同的咖啡中有機(jī)酸成分也有差異，大多咖啡中蘋果酸含量最高[19]。本研究根據(jù)GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》對咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中的總酸含量進(jìn)行滴定，以蘋果酸為基準(zhǔn)衡量總酸含量。發(fā)酵第4 天總酸含量為0.377 mg/mL，pH 值為4.40。發(fā)酵的前20 d 總酸含量有顯著的上升，在發(fā)酵第20 天總酸含量達(dá)到7.17 mg/mL，pH 值也相應(yīng)下降為4.38，這可能與部分微生物（包含醋酸菌、乳酸菌等）大量生長繁殖產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)有關(guān)[20]。發(fā)酵第20 天至第32 天總酸含量有所下降，發(fā)酵32 d 過后又逐漸上升，并于第48 天達(dá)到8.17 mg/mL?？偟膩碚f，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酸含量上升，pH 值有所下降，但并不是每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩者都呈現(xiàn)完全的負(fù)相關(guān)，這可能與咖啡果皮酵素中某些新生產(chǎn)的有機(jī)酸的緩沖性有關(guān)[21]，因此我們對發(fā)酵過程中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生的有機(jī)酸[22]（包括乳酸和醋酸）的含量進(jìn)行了分析。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸和醋酸含量變化

發(fā)酵過程中乳酸和醋酸含量變化見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中乳酸和醋酸含量變化Fig.3 Changes of lactic acid and acetic acid in the fermentation process

為確定檢測到的乳酸和醋酸是否為后期產(chǎn)生，本研究選擇了同批咖啡果皮原料，按照酵素制備過程中的原料與其它添加成分比，即按咖啡果皮∶水=3∶4（質(zhì)量比）進(jìn)行超聲輔助提取40 min，對提取液中的乳酸和醋酸進(jìn)行檢測，并記為第0 天數(shù)據(jù)。如圖3，發(fā)酵前咖啡果皮中本身包含乳酸和醋酸含量分別為1.45 mg/mL和0.38 mg/mL，發(fā)酵過程中乳酸和醋酸的含量均顯著上升，乳酸含量在發(fā)酵第24 天達(dá)到最高，為2.79 mg/mL，之后趨于穩(wěn)定，說明后期發(fā)酵過程中有乳酸菌的生長代謝進(jìn)一步生成了乳酸。醋酸含量在發(fā)酵前16 d 上漲緩慢，在第16 天含量為0.67 mg/mL，之后含量出現(xiàn)顯著上升，在發(fā)酵第32 天達(dá)到2.21 mg/mL，之后逐漸趨于平穩(wěn)。發(fā)酵前期酵母菌和醋酸菌菌液濃度含量較低，發(fā)酵液中富含豐富的糖類物質(zhì)，醋酸菌在糖源充足的情況下直接利用葡萄糖發(fā)酵生成醋酸[23]，在酵母菌發(fā)酵生成大量乙醇后，醋酸菌將乙醇氧化成乙醛，進(jìn)一步生成醋酸[24]。食醋中曲霉、酵母菌、醋酸菌具有一定的協(xié)同作用[25]，為進(jìn)一步研究植物酵素中醋酸菌和酵母菌之間的關(guān)系，對咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中的乙醇含量進(jìn)行了分析。

2.4 發(fā)酵過程中乙醇含量變化

圖4是發(fā)酵過程中乙醇含量的趨勢圖。

圖4 發(fā)酵過程中乙醇含量變化Fig.4 Changes of ethanol content in the fermentation process

植物酵素天然發(fā)酵主要是利用植物表面本身所帶有的微生物進(jìn)行的，酵母菌作為植物酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群[22]，利用糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)生乙醇，乙醇被醋酸菌消耗生成醋酸。故對乙醇含量的檢測有助于進(jìn)一步明確發(fā)酵狀態(tài)。如圖4，在發(fā)酵前16 d，乙醇含量上升尤為顯著，到發(fā)酵第16 天乙醇含量達(dá)到最高，為2.94%，發(fā)酵16 d 后乙醇含量逐漸降低，于發(fā)酵第32天降低到2.00%，并趨于平穩(wěn)。管章瑞等[17]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓發(fā)酵過程中乙醇含量在發(fā)酵前6 d 不斷上升，在第6 天達(dá)到最高，為64.32 mg/mL，隨后乙醇含量逐漸降低，30 d 后乙醇含量降為23.69 mg/mL。結(jié)合發(fā)酵過程中醋酸的含量變化圖可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期，酵母菌大量利用體系內(nèi)的糖類物質(zhì)合成乙醇，隨著乙醇濃度的上升，酵母菌大量生長繁殖?？偺菨舛鹊南陆?、乙醇含量的上升抑制了酵母菌進(jìn)一步的生長和代謝。乙醇逐漸被醋酸菌消耗生成醋酸，這就是發(fā)酵16 d 后醋酸含量上升伴隨乙醇含量下降的原因。

2.5 發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量的變化

發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化見圖5。

為研究咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量變化，本研究采用考馬斯亮藍(lán)法對咖啡果皮酵素中的可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了檢測。如圖5所示，發(fā)酵前8 d，咖啡果皮酵素中蛋白質(zhì)含量僅有輕微的上升，在第8天達(dá)到3.34 mg/mL，這可能與原料中本身的蛋白質(zhì)溶出有關(guān)，發(fā)酵8 d 至24 d，咖啡果皮酵素中可溶性蛋白質(zhì)含量有較為明顯的上升，在發(fā)酵第24 天達(dá)到最高，為0.60 mg/mL。隨后一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)含量趨于平衡，發(fā)酵第40 天蛋白質(zhì)含量逐漸下降，在第48 天為0.50 mg/mL。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期，微生物生長繁殖能力不強(qiáng)，較高濃度的糖抑制了原料中的蛋白質(zhì)溶出。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定，微生物開始大量繁殖，部分微生物所產(chǎn)生的纖維素酶和果膠酶[26-27]使咖啡果皮細(xì)胞壁破裂，蛋白質(zhì)大量溶出。同時(shí)，微生物的代謝也產(chǎn)生了部分小分子蛋白質(zhì)，導(dǎo)致含量上升。經(jīng)過24 d 的發(fā)酵之后，體系逐漸趨于平衡，蛋白質(zhì)含量也逐漸趨于穩(wěn)定。經(jīng)過40 d 的發(fā)酵，總糖含量下降，微生物生長繁殖速率減慢，蛋白質(zhì)被部分消耗，含量有所下降。

圖5 發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化Fig.5 Changes of soluble protein in the fermentation process

2.6 發(fā)酵過程中總酚含量變化

發(fā)酵過程中總酚含量變化見圖6。

圖6 發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.6 Changes of total phenolic content in the fermentation process

為研究咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中的多酚含量變化，采用福林酚法對總酚含量進(jìn)行檢測。如圖6，咖啡果皮酵素在發(fā)酵前20 d 含量顯著上升，在發(fā)酵第20天達(dá)到1.71 mg/mL，后逐漸趨于平衡，前期總酚含量的上升主要是因?yàn)槲⑸镒饔脤?dǎo)致咖啡果皮本身酚類物質(zhì)的溶出有關(guān)。發(fā)酵第28 天～第32 天含量有輕微下降，之后又緩慢上升，在發(fā)酵第48 天達(dá)到1.81 mg/mL。多酚類物質(zhì)具有一定的抑菌效果[28]，高濃度的多酚類物質(zhì)也會(huì)抑制微生物的生長。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，部分微生物逐步適應(yīng)高酚含量發(fā)酵環(huán)境，并逐漸將一些一大分子量的多酚被降解為小分子量酚類物質(zhì)或單體酚[29]，從而使總酚含量進(jìn)一步的小幅上升。

2.7 發(fā)酵過程中抗氧化能力變化

2.7.1 DPPH 自由基清除能力變化

咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中對DPPH 自由基清除能力的變化情況如圖7所示。

圖7 發(fā)酵過程中對DPPH自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in DPPH free radical scavenging ability during the fermentation

在整個(gè)發(fā)酵過程中咖啡果皮酵素對DPPH 自由基都具有一定的清除能力，發(fā)酵過程中前36 d 呈現(xiàn)緩慢上升，咖啡果皮酵素對DPPH 自由基的清除能力逐漸上升，發(fā)酵36 d 過后，清除能力進(jìn)一步顯著上升。說明適當(dāng)?shù)难娱L發(fā)酵時(shí)間有利于提高咖啡果皮酵素對DPPH 自由基的清除能力。與發(fā)酵過程中總酚含量相比發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酚含量和對DPPH 自由基的清除能力都有顯著的提高，說明兩者之間具有一定的相關(guān)性。但整個(gè)發(fā)酵過程中總酚含量與DPPH自由基的清除能力并沒有呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。而是在總酚的大量積累后清除率顯著上升，這可能與原料中本身含有的酚類性質(zhì)有關(guān)。

2.7.2 ABTS+自由基清除能力變化

發(fā)酵過程中咖啡果皮酵素對ABTS+自由基的清除能力如圖8所示。

整個(gè)發(fā)酵過程中，稀釋75 倍后的咖啡果皮酵素對ABTS+自由基具有良好的的清除能力，且均大于50%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，對ABTS+自由基的清除能力不斷上升，在發(fā)酵第48 天時(shí)達(dá)到91.74%。說明適當(dāng)?shù)难娱L發(fā)酵時(shí)間有利于提高咖啡果皮酵素對ABTS+自由基的清除能力。相比咖啡果皮酵素對DPPH 自由基清除能力而言，ABTS+自由基清除能力與總酚含量的變化趨勢相似度更為明顯。Floegel A 等[30]對50 種具有富含抗氧化劑的水果的ABTS+自由基清除能力與總酚和黃酮含量做了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ABTS+自由基清除能力與總酚和黃酮含量呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，這可能是本研究中ABTS+自由基清除能力與總酚含量變化趨勢較為明顯的原因。

圖8 發(fā)酵過程中對ABTS+自由基清除能力的變化Fig.8 Changes in ABTS+free radical scavenging ability during the fermentation

2.8 不同發(fā)酵時(shí)間咖啡果皮酵素聚類分析

圖9為咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中各指標(biāo)特征聚類圖。

圖9 咖啡果皮酵素不同發(fā)酵時(shí)間各指標(biāo)特征聚類圖Fig.9 Characteristic clustering of different indexes in different fermentation times of coffee peel

整個(gè)發(fā)酵過程中，檢測參數(shù)較多，發(fā)酵階段難以確定，本研究采用SPSS 將發(fā)酵過程中所有檢測參數(shù)進(jìn)行聚類分析，確定不同的發(fā)酵階段。聚類分析結(jié)果代表不同階段總糖、總酸、pH 值、乙醇、乳酸、醋酸、蛋白質(zhì)、總酚以及抗氧化指標(biāo)的總體變化規(guī)律。如圖9所示，橫坐標(biāo)表示差異性，數(shù)值越大，表示不同發(fā)酵時(shí)間咖啡果皮酵素的差異越大，本研究選擇了λ=5 分類，12 個(gè)不同的發(fā)酵時(shí)間分為3 類：第一類發(fā)酵時(shí)間為4 d，第二類發(fā)酵時(shí)間為：8 d～20 d，第三類為發(fā)酵第24 天及以后。

2.9 相關(guān)性分析

為研究咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中各種代謝產(chǎn)物，如總糖、總酸、pH 值、乳酸、醋酸、乙醇、蛋白質(zhì)、總酚與抗氧化指標(biāo)（DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力）之間的內(nèi)在聯(lián)系，通過相關(guān)性分析確定各組分之間的聯(lián)系，如表1所示。

表1 發(fā)酵過程中各參數(shù)相關(guān)性Table 1 Correlation of parameters during fermentation

通過表1可以發(fā)現(xiàn)，總糖與pH 值與乙醇含量呈正相關(guān)，與總酸、蛋白質(zhì)、乳酸、醋酸含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。這可能與發(fā)酵過程中微生物利用糖合成乙醇、蛋白質(zhì)，代謝產(chǎn)生有機(jī)酸和其它酸類物質(zhì)有關(guān)。乙醇與醋酸含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，是因?yàn)榘l(fā)酵16 d 后乙醇逐漸被微生物利用合成醋酸?？偡雍颗cABTS+自由基清除能力和DPPH 自由基清除能力有顯著的相關(guān)性，酚類物質(zhì)本身就具有良好的抗氧化功效，發(fā)酵過程中隨著總酚含量的上升，抗氧化功效顯著提高。

2.10 主成分分析

主成分分析的載荷圖如圖10所示。

圖10 主成分分析的載荷圖Fig.10 Principal component analysis of the load diagram

為進(jìn)一步明確咖啡果皮酵素發(fā)酵過程中，各變量總糖、總酸、pH 值、乙醇、乳酸、醋酸、蛋白質(zhì)、總酚、DPPH 自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力的相互關(guān)系，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）對各個(gè)變量進(jìn)行降維處理。抽取能夠代表大部分信息的第一主成分（貢獻(xiàn)率為69.352%）和第二主成分（貢獻(xiàn)率為19.698%），各檢測指標(biāo)的位置越接近，說明這些指標(biāo)之間的相關(guān)性越好。如圖10 所示，總糖、pH 值、乙醇在第一主成分和第二主成分中的系數(shù)分別為負(fù)值和正值，說明其主要貢獻(xiàn)為第二主成分。其它參數(shù)均位于載荷圖的右側(cè)，表示對第一主成分貢獻(xiàn)率較大；其中總酸、總酚、乳酸、ABTS+自由基清除能力第二主成分系數(shù)大于0，且彼此之間距離相差不大，說明這4 個(gè)檢測指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，DPPH 自由基清除能力略小于0，但與總酚、ABTS+自由基清除能力距離較近。說明三者之間相關(guān)性較好；蛋白質(zhì)與醋酸含量位于右下角，與總糖、pH 值、乙醇含量相反，這與前面相關(guān)性分析的結(jié)果基本一致。

12 個(gè)不同時(shí)間的咖啡果皮酵素的主成分樣品得分圖如圖11所示。

圖11 主成分樣品得分圖Fig.11 Main component sample score chart

發(fā)酵第4 天的咖啡果皮酵素位于圖像左下角，與其他時(shí)間點(diǎn)相比相距較遠(yuǎn)，說明與其它發(fā)酵時(shí)間酵素性質(zhì)差別較大。發(fā)酵第8 天到第20 天的咖啡果皮酵素位于圖片左上方，第一主成分系數(shù)和第二主成分系數(shù)都有了較為顯著的上升，但第一主成分系數(shù)還是為負(fù)值。發(fā)酵第24 天到第28 天第一主成分占據(jù)了絕對優(yōu)勢。因此，將不同發(fā)酵時(shí)間的咖啡果皮酵素按照主成分得分分為3 個(gè)區(qū)域：N1、N2 和N3。這也與聚類分析結(jié)果一致。通過主成分分析法構(gòu)建不同發(fā)酵時(shí)間樣品的綜合評價(jià)指標(biāo)（comprehensive evaluation index，CEI）。以每個(gè)主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分的特征值之和的比例，進(jìn)行線性加權(quán)求和得到CEI（如公式1）。

不同發(fā)酵時(shí)間的咖啡果皮酵素綜合指標(biāo)如圖12所示。

圖12 咖啡果皮酵素綜合評價(jià)指標(biāo)Fig.12 Comprehensive evaluation index of coffee peel jiaosu

發(fā)酵第4 天CEI 值最低，為-1.995，隨后CEI 值有所提高，并在第24 天時(shí)達(dá)到0.323，隨后輕微的下降之后繼續(xù)上升，在發(fā)酵第48 天達(dá)到最高，為1.027。說明適當(dāng)?shù)难娱L發(fā)酵時(shí)間有利于提高咖啡果皮酵素綜合指標(biāo)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以咖啡制作過程中廢棄的咖啡果皮為原料，利用咖啡果皮表面的微生物，在高濃度糖液濃度下制備咖啡果皮酵素。對發(fā)酵過程中總糖、總酸、乳酸、醋酸、乙醇、總酚含量、pH 值及抗氧化指標(biāo)（DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力）進(jìn)行了檢測和分析。結(jié)果表明：發(fā)酵過程可以分為0～4 d、8 d～20 d、24 d～48 d 3 個(gè)不同時(shí)間段。微生物在發(fā)酵前期生長繁殖較慢，咖啡果皮在高糖濃度下活性物質(zhì)和水分溶出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物大量生長產(chǎn)生乙醇、醋酸、乳酸和酶等代謝產(chǎn)物，乙醇在后期被醋酸菌代謝導(dǎo)致含量下降。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)含量上升，咖啡果皮物質(zhì)進(jìn)一步溶出，總酚含量顯著上升，兩個(gè)抗氧化指標(biāo)也隨之出現(xiàn)顯著上升。發(fā)酵過程中不同檢測指標(biāo)之間具有一定的相關(guān)性，通過主成分分析發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，綜合指標(biāo)顯著提高，說明適當(dāng)?shù)难娱L發(fā)酵時(shí)間有利于提高咖啡果皮酵素成熟度和抗氧化功效。