甘霖 吳景 楊玉雙

摘 要 為了在總RNA水平上揭示橡膠草SSR分布規(guī)律和特性，利用GRAMENE網(wǎng)站提供的SSR鑒定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），對(duì)橡膠草6 756條無(wú)冗余的EST分別進(jìn)行SSR鑒定。結(jié)果共搜查到2 761個(gè)1～6堿基SSR，出現(xiàn)頻率最高的為單堿基重復(fù)基元類型，其次為三堿基重復(fù)基元類型與二堿基重復(fù)基元類型，分別為2 139、338與219個(gè)，其出現(xiàn)頻率分別為77.5%、12.2%與7.9%。AG/CT為二核苷酸中優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，占其總數(shù)的73.1%；而AAG/CTT與ACC/GGT則為三核苷酸中優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，二者分別占三核苷酸SSR總數(shù)的24.3%與23.7%。設(shè)計(jì)了20對(duì)SSR引物并驗(yàn)證了它們?cè)谄压?個(gè)高度近緣種共24個(gè)不同個(gè)體中的存在情況。結(jié)果表明，引物擴(kuò)增率為100%，多態(tài)率為95%，能夠在DNA水平上將橡膠草（TKs）與其他2個(gè)高度近緣種短喙蒲公英（TB）及藥用蒲公英（TO）有效地區(qū)分開(kāi)。由此表明，將所開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記用于橡膠草種質(zhì)鑒定、蒲公英屬不同種間多態(tài)性檢測(cè)和彼此區(qū)分是可行的。

關(guān)鍵詞 橡膠草 ；轉(zhuǎn)錄組 ；SSR ；種質(zhì)鑒定

中圖分類號(hào) Q756 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.01.009

Abstract Russian dandelion is an important crop for natural rubber. In this study， simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in Russian dandelion. A total of 2 761 SSRs were found in 6 756 unique root transcripts. Of the 2 761 SSRs， the most abundant SSR is the mon- nucleotide type， with the SSR numbers being 2 139， followed by the tri- and di- nucleotide ones， with 338 and 219 SSR numbers， accounting for 77.5%，12.2%，and 7.9%， respectively. Among the di-nucleotide repeats， AG/CT was the most motifs and accounted for 73.1%. However，AAG/CTT and ACC/GGT were both the most frequent motif among the tri-nucleotide repeats， accounting for 24.3% and 23.7%，respectively. 20 pairs of SSR primers were designed and tested for the presence of 24 individuals in 3 closely related species of Taraxacum. The results showed that the amplification efficiency was 100%， and the polymorphism efficiency was 95%. It could separate the Taraxacum kok-saghyz （TKs） from the other 2 relatives， Taraxacum brevirostre （TB） and Taraxacum officinale （TO）， at DNA level. These results indicated that the developed SSR markers could be used for germplasm identification of TKs， and it was feasible to detect and differentiate different species between Taraxacum.

Key words russian dandelion ； transcriptome ； SSR ； germplasm identification

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin， TKs）又名俄羅斯蒲公英（Russian dandelion），為菊科蒲公英屬多年生草本植物，根部含有豐富的天然橡膠。原產(chǎn)于哈薩克斯坦、歐洲以及中國(guó)新疆等地，野生種質(zhì)常分布于鹽堿化草甸、河漫灘草甸及農(nóng)田水渠邊。甘肅、陜西以及東北、華北、西北等地也有分布[1]。橡膠草適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)收獲期短，適合機(jī)械化種植和采收，并且具有較強(qiáng)的抗病蟲(chóng)、抗寒、抗旱能力以及較好的生物相容性、抗過(guò)敏性等優(yōu)點(diǎn)，成為具有發(fā)展前途的巴西橡膠樹(shù)橡膠替代作物[2]。另外，橡膠草也是研究植物產(chǎn)膠機(jī)理的良好模式植物和生物反應(yīng)器，其根、葉中可以提取菊糖，提膠后的殘?jiān)梢约庸こ删凭?、沼氣，并且具有一定藥用價(jià)值。橡膠草在模式植物研究、工業(yè)原料生產(chǎn)和生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)換等領(lǐng)域均具有較好的發(fā)展前景[3]，有助于緩解面臨的能源和戰(zhàn)略原材料短缺問(wèn)題。由于目前國(guó)內(nèi)對(duì)這一資源還缺乏系統(tǒng)的保護(hù)，對(duì)其遺傳育種方面的研究更是滯后；此外，橡膠草原產(chǎn)地的過(guò)度放牧使野生橡膠草資源面臨著滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。因此如何快速對(duì)野生橡膠草資源進(jìn)行系統(tǒng)搜集保存，利用現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)快速開(kāi)展育種研究，挖掘其產(chǎn)膠潛能有著十分重要的意義。

SSR分子標(biāo)記因其具有信息量豐富、多等位性以及共顯性等特點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用，目前已成功從多種植物和微生物中開(kāi)發(fā)出了SSR標(biāo)記。一般而言，物種全基因組測(cè)序會(huì)受到基因組大小、重復(fù)序列及雜合度的影響，加之成本高，這使得短時(shí)間內(nèi)獲得大量序列信息面臨著挑戰(zhàn)。然而Denovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不依賴于種基因組，能夠快速、廉價(jià)地獲得物種全轉(zhuǎn)錄本序列信息，其中蘊(yùn)含著大量可用的SSR標(biāo)記。本文利用已公布的橡膠草75 868條轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中查找并分析橡膠草SSR序列信息，旨在總RNA水平上揭示橡膠草SSR分布規(guī)律和特性，同時(shí)為橡膠草遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因的定位和克隆、系譜分析提供實(shí)用的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

從PlantGDB網(wǎng)站（http：//www.plantgdb.org）下載75 868條橡膠草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。SSR擴(kuò)增用的24份材料采集自中國(guó)新疆伊犁地區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及其SSR位點(diǎn)篩選

利用blast軟件進(jìn)行比對(duì)，相似度≥80%的默認(rèn)為同一序列，按照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行去冗余拼接獲得Unigene；利用SSRIT在線分析軟件（http：//www.gramene.org/db/searches/ssrtool）對(duì)獲得的無(wú)冗余Unigene進(jìn)行SSR鑒定。以重復(fù)序列總長(zhǎng)≥24 bp作為SSR篩選標(biāo)準(zhǔn)，即單核苷酸，二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別在24次、12次、8次、6次、5次、4次以上。

1.2.2 SSR引物設(shè)計(jì)及多態(tài)性分析

對(duì)鑒定出的各EST-SSR進(jìn)行比較，對(duì)于含同一個(gè)重復(fù)基元的多條Unigene，優(yōu)先選取重復(fù)序列長(zhǎng)、重復(fù)次數(shù)多的片段，在重復(fù)基元上下游合適的位置設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)原則為： GC含量45%～65%，Tm值55～65℃，引物序列長(zhǎng)18～25 bp，且無(wú)錯(cuò)配、無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。DNA提取參照天根DNA提取試劑盒方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增及多態(tài)性分析參照黃海燕等[4]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠草EST-SSR類型及頻率分析

對(duì)75 868條橡膠草轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行去冗余和組裝拼接，得到6 756條Unigene，總長(zhǎng)度為5.13×106 bp。共鑒定到2 761個(gè)SSR，分布于2 376條無(wú)冗余的EST上，發(fā)生頻率為35.2%（含有SSR的EST與無(wú)冗余EST數(shù)之比），SSR平均分布距離為1.86 kb。其中有323條Unigene包含有1個(gè)以上SSR（表1）。在2 761個(gè)SSR中，單核苷酸以及二、三、四、五、六核苷酸SSR分別為2 139、219、338、8、11和46個(gè)，出現(xiàn)頻率分別為77.5%、7.9%、12.2%、0.3%、0.4%與1.7%（圖1）。其中，二、三核苷酸基元類型分布最為廣泛，以AG/CT基元為最豐富類型；在三核苷酸SSR中共存在10種不同基元類型，其中AAG/CTT與ACC/GGT為主導(dǎo)類型。

2.2 橡膠草EST-SSR多態(tài)性預(yù)測(cè)及引物設(shè)計(jì)

SSR標(biāo)記多態(tài)性與其基元重復(fù)數(shù)密切相關(guān)[5]，往往重復(fù)數(shù)越高，其變異概率越大[6-7]，多態(tài)性越顯著。多態(tài)性是判斷分子標(biāo)記是否可用的一個(gè)重要依據(jù)。為了提高引物的多態(tài)率，本研究將24 bp以下的低多態(tài)潛能SSR過(guò)濾掉，保留了重復(fù)次數(shù)依次為24、12、8、6、5及4次以上的單、二、三、四、五和六核苷酸Unigene。共鑒定到大于24 bp的SSR 303個(gè)（表2），占總SSR的11%。分別在303個(gè)EST-SSR的上下游合適位置設(shè)計(jì)引物，推測(cè)這些SSR在橡膠草上具有比較豐富的多態(tài)性。表3僅列出了其中20對(duì)SSR引物。

2.3 引物有效性檢測(cè)

為了檢測(cè)已設(shè)計(jì)的20對(duì)SSR引物在蒲公英屬不同植株中的存在情況，分別對(duì)24份DNA進(jìn)行擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對(duì)引物在橡膠草基因組DNA中均能有效擴(kuò)增（圖2，部分結(jié)果），其中具有多態(tài)性的19對(duì)引物均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，占總引物數(shù)的95%。有的引物對(duì)甚至能擴(kuò)出2個(gè)及以上的等位基因，如引物對(duì)Ts491F/R在橡膠草中能特異擴(kuò)增出單一目標(biāo)帶，而在其它材料中存在2個(gè)或以上等位基因的情況（圖2-i）。引物對(duì)Ts767F/R擴(kuò)增出來(lái)的條帶中存在明顯的大小差異（圖2-c）；引物對(duì)Ts451F/R及引物對(duì)Ts661F/R擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小差異多態(tài)明顯（圖2-d，2-g）。可見(jiàn)，基于橡膠草EST-SSR序列所開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記在橡膠草植株中能夠較好地?cái)U(kuò)增，而且能夠在DNA水平上將橡膠草與其他2個(gè)近緣種短角蒲公英（TB）及普通蒲公英（TO）進(jìn)行較好地區(qū)分。說(shuō)明所開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)蒲公英屬進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)和篩選是可行的。

3 討論

由于橡膠草與蒲公英屬的其他2個(gè)高度近緣種短喙蒲公英（TB）及藥用蒲公英（TO）在形態(tài)上極為相似，因此如何快速、準(zhǔn)確地鑒定橡膠草資源，挖掘優(yōu)異種質(zhì)并及時(shí)開(kāi)展物種保護(hù)具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的依托植株外形進(jìn)行品種鑒定或橡膠含量判定的辦法往往存在較大的誤差，可能降低育種以及品種改良的效率。因此，通過(guò)SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證技術(shù)，快速準(zhǔn)確地鑒定橡膠草種質(zhì)，尋找與橡膠含量連鎖的SSR分子標(biāo)記，開(kāi)展分子標(biāo)記輔助（MAS）育種，將是獲得高產(chǎn)橡膠草品系的快捷途徑。

SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多物種的遺傳多樣性、連鎖圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)及關(guān)聯(lián)分析等領(lǐng)域[8-9]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷升級(jí)以及測(cè)序成本不斷降低，越來(lái)越多的物種基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)被釋放和公布，這為廣覆蓋、高效開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記提供了快速途徑[10]。本研究對(duì)橡膠草的6 756條無(wú)冗余Unigene進(jìn)行了SSR鑒定，共篩選到2 761個(gè)1～6堿基SSR，分布在2 376條無(wú)冗余的EST上，發(fā)生頻率為35.2%。在搜索出來(lái)的SSR中，其中出現(xiàn)頻率最高的為單堿基重復(fù)基元類型，其次為三堿基重復(fù)基元類型與二堿基重復(fù)基元類型。SSR平均分布距離為1/1.86 kb，低于安澤偉等[11]此前報(bào)道的巴西橡膠樹(shù)的EST-SSR數(shù)值1/3.93 kb。

在本研究中，二堿基重復(fù)基元類型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT、AT/AT等3種類型，其中AG/CT為主導(dǎo)類型；而在三堿基重復(fù)基元類型中共存在10種不同基序，其中AAG/CTT與ACC/GGT為主導(dǎo)類型，這與巴西橡膠樹(shù)EST-SSR類似，其以二堿基和三堿基重復(fù)基元為主，分別以AG/TC和CTT/GAA為最多[11]。

為增大后續(xù)SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的成功率，本研究過(guò)濾了多態(tài)潛能較低的24 bp以下SSR，最終獲得303個(gè)SSR。驗(yàn)證了20對(duì)SSR引物在蒲公英屬不同植株中的存在情況，對(duì)24份DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果表明，引物均能在橡膠草基因組DNA中有效擴(kuò)增；而且19對(duì)引物均顯示出多態(tài)性。如圖2所示，9對(duì)引物中的任意一對(duì)均能將TKs、TB及TO區(qū)分開(kāi)，這在種質(zhì)分子鑒定中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。本研究所獲得的引物在橡膠草中是否如推測(cè)的那樣具有豐富的多態(tài)性以及如何獲得能夠精細(xì)地將每個(gè)個(gè)體進(jìn)行區(qū)分的分子標(biāo)記，如何得到通用性及多態(tài)性更好的引物，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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