何東明

上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 201210

“你的數(shù)據(jù)(data)能支持你的結(jié)論嗎？”這是自然科學(xué)研究里最核心的、也是很多科研工作者時(shí)常會(huì)聽到的問題。堿基編輯器(base editor，BE)這一重要的基因編輯技術(shù)，就遇上了這樣的難題——脫靶是否嚴(yán)重？脫靶可能帶來致癌等嚴(yán)重的副作用，因此在真正走上臨床應(yīng)用之前，本著對(duì)人類與科學(xué)負(fù)責(zé)任的應(yīng)有態(tài)度，一直有研究者提問，這些技術(shù)真的安全嗎，現(xiàn)在數(shù)據(jù)支持它不會(huì)脫靶嗎？遺憾的是，此前的數(shù)據(jù)無法給出答案。

2019年3月1日，中國兩個(gè)科研團(tuán)隊(duì)在國際頂尖學(xué)術(shù)雜志《Science》同時(shí)發(fā)表論文，報(bào)告了在基因編輯研究中取得重大突破，一致闡明了堿基編輯器脫靶的奧秘。一篇論文是中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝教授團(tuán)隊(duì)的《胞嘧啶堿基編輯器對(duì)小鼠胚胎進(jìn)行編輯會(huì)出現(xiàn)大量單核苷酸突變的脫靶效應(yīng)》(Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos)[1]；另一篇是中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞教授團(tuán)隊(duì)的《胞嘧啶堿基編輯器，而不是腺嘌呤編輯器對(duì)水稻進(jìn)行編輯會(huì)產(chǎn)生全基因組范圍的脫靶效應(yīng)》(Cytosine, but not adenine, base editors induce genomewide off-target mutations in rice)[2]。這兩項(xiàng)分別在動(dòng)植物系統(tǒng)開展的研究得出一致的結(jié)論：胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor，CBE，包括BE3、高保真版BE3，即HF-BE3)，包括先前認(rèn)為高精確度的BE3，都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的全基因組范圍內(nèi)的單核苷酸突變(single nucleotide variants，SNVs)；同時(shí)，設(shè)計(jì)良好的經(jīng)典CRISPR/Cas9技術(shù)不存在顯著脫靶效應(yīng)。由此結(jié)束了關(guān)于基因編輯脫靶是否嚴(yán)重的持久爭(zhēng)議。這些成果對(duì)構(gòu)建嚴(yán)格精準(zhǔn)的脫靶檢測(cè)系統(tǒng)，從而研發(fā)更精準(zhǔn)安全的基因編輯技術(shù)有重要意義，將顯著推動(dòng)基礎(chǔ)研究到精準(zhǔn)疾病治療或種質(zhì)改良等方面的技術(shù)轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 基因編輯脫靶疑團(tuán)

堿基編輯器是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的一種重要衍生技術(shù)，由于能實(shí)現(xiàn)精確度很高的單堿基定點(diǎn)突變，已顯著改變基礎(chǔ)研究與臨床研究，被視為突破許多疾病治療等難題的希望。該技術(shù)現(xiàn)主要包括胞嘧啶編輯器、腺嘌呤編輯器(adenine base editor，ABE)，其中CBE還發(fā)展出了BE3。此前研究發(fā)現(xiàn)BE3脫靶效應(yīng)不顯著，但由于無法得出嚴(yán)謹(jǐn)有效的科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論，該問題一直處于爭(zhēng)議之中。

實(shí)際上，自CRISPR-Cas9技術(shù)出現(xiàn)以來，科學(xué)家對(duì)其脫靶風(fēng)險(xiǎn)高低的爭(zhēng)議就從沒有停息過。考慮到人類有許多疾病是單堿基突變，后續(xù)就開發(fā)了可實(shí)現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)突變的CRISPR/Cas9技術(shù)。但存在的一個(gè)問題是，該編輯技術(shù)會(huì)使DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks，DSBs)，通過包括了非同源末端連接修復(fù)(non-homologous end joining，NHEJ)的機(jī)制來引入定點(diǎn)突變。然而，NHEJ是一種高效但精確度很低的修復(fù)方式，因此存在著很大的隱患。許多研究發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)可能會(huì)存在顯著的脫靶效應(yīng)、大量的插入/缺失突變(insertions/deletions，indels)或點(diǎn)突變，其中不乏具有致癌風(fēng)險(xiǎn)的突變[3]。

堿基編輯器這一重要CRISPR衍生技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)不依賴于DSB的單堿基定點(diǎn)突變。2016年10月，《Nature Biotech》發(fā)表了第一個(gè)堿基編輯器胞嘧啶編輯器研發(fā)的重大成果[4]。領(lǐng)導(dǎo)該開創(chuàng)性研究的科學(xué)家是華人學(xué)者、哈佛大學(xué)教授劉如謙。他們將大鼠的胞嘧啶脫氨酶(rAPOBEC1)與全失活的Cas9(dead Cas9，dCas9)融合，發(fā)現(xiàn)其可以將特定位點(diǎn)C轉(zhuǎn)變?yōu)?U，通過后續(xù)DNA 復(fù)制或以高精確性的同源重組修復(fù)(homology-directed repair，HDR)機(jī)制來介導(dǎo)C : G堿基對(duì)到 T : A 的轉(zhuǎn)變(圖1)。其中通過添加UGI研發(fā)成的第三代CBE系統(tǒng)——BE3，能實(shí)現(xiàn)15 %～75 %的編輯效率，在相同精確度下，比CBE之前的技術(shù)提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)(CBE之前為0.1 %～5 %)。值得一提的是，其研究發(fā)現(xiàn)BE3脫靶效應(yīng)很低，與未處理的對(duì)照組一樣，僅約0.02 %(表1)。此后許多其他學(xué)者的研究也得出類似的結(jié)果。

2017年10月，劉如謙教授在《Nature》上發(fā)表了另一項(xiàng)重大突破：通過改造大腸桿菌的tRNA腺苷脫氨酶(TadA)，研發(fā)出第 7 代腺嘌呤堿基編輯器，能高效實(shí)現(xiàn)A : T堿基對(duì)到 G : C 的轉(zhuǎn)變[5]。ABE具有高達(dá)50 %的編輯效率，脫靶率也更低。至此，C 到 T 以及 G 到A 堿基之間的自由編輯技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，在人類各種細(xì)胞系和疾病基因修復(fù)方面也顯示出很好的編輯效果，這顯著加快了該技術(shù)往臨床的應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

圖1 胞嘧啶編輯器BE1的設(shè)計(jì)原理[4]。向?qū)NA通過靶位點(diǎn)胞嘧啶(紅色)所處的基因座上的特異識(shí)別位點(diǎn)，來介導(dǎo)dCas9(藍(lán)色)與靶基因結(jié)合，使局部DNA鏈發(fā)生分離。通過編輯器上連接著的APOBEC1酶(紅色)使單鏈上的目標(biāo)胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。其后經(jīng)過DNA復(fù)制或DNA修復(fù)過程，所生成的G:U異源雙鏈體就可永久轉(zhuǎn)化為堿基對(duì)A:T

表1 BE3對(duì)人類細(xì)胞進(jìn)行編輯的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其脫靶產(chǎn)生的C/G突變效應(yīng)與未處理對(duì)照組一樣[4]

在利益的驅(qū)動(dòng)下，一系列的基因編輯技術(shù)臨床試驗(yàn)競(jìng)相涌現(xiàn)并獲審批通過，但學(xué)術(shù)界內(nèi)并沒有給出最終的定論，因?yàn)檫@些檢測(cè)方法都顯得不夠嚴(yán)謹(jǐn)?，F(xiàn)有脫靶檢測(cè)手段，主要有軟件預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序檢測(cè)DSB產(chǎn)生。這些方法都存在較大局限性，不能高靈敏度地檢測(cè)脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。再就是，這些研究采用的所謂單細(xì)胞測(cè)序，實(shí)際上并不是實(shí)驗(yàn)組的一個(gè)細(xì)胞與對(duì)照組的一個(gè)細(xì)胞的基因組的直接測(cè)序比對(duì)，而是單個(gè)細(xì)胞基因組經(jīng)過大量擴(kuò)增后得出來的平均效應(yīng)。在擴(kuò)增過程中會(huì)產(chǎn)生大量的背景信號(hào)，這是目前技術(shù)上的硬傷。

2017年5月，《Nature》發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于CRISPR脫靶的研究報(bào)告引起了轟動(dòng)。Bassuk等數(shù)位科學(xué)家基于同一品系的小鼠遺傳背景一致的假設(shè)，研究了基因編輯技術(shù)的脫靶問題。他們通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯小鼠的受精卵，待其發(fā)育成小鼠出生后，將它們與同一品系的其他小鼠的基因組測(cè)序結(jié)果作對(duì)比，結(jié)果居然發(fā)現(xiàn)了1 000多處此前未預(yù)料到的突變。研究發(fā)表后，很快就遭到科學(xué)家的各種質(zhì)疑。除了實(shí)驗(yàn)樣本相當(dāng)不足，另一個(gè)很重要的原因就是作者也許忽略了，即使在實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格培育的同一品系，個(gè)體之間也有很大的遺傳差異。個(gè)體間的遺傳差異，可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脫靶效應(yīng)信號(hào)本身，又如何區(qū)分差異是不是屬于脫靶效應(yīng)呢？所以這些對(duì)照并非合格的對(duì)照。隨后，該論文在媒體喧鬧與學(xué)界質(zhì)疑聲中被撤稿了。因此，脫靶疑團(tuán)不解開，該技術(shù)發(fā)展就很難推進(jìn)。

2 中國科學(xué)家巧妙試驗(yàn)終攻破難題

在大量背景信號(hào)的顯著干擾下，脫靶效應(yīng)猶如茫茫大海里一根特別的細(xì)針，該如何找出呢?也許，只有等整個(gè)大海都干了，就是背景噪音都完全消除了，這根針才能顯露出來。楊輝團(tuán)隊(duì)巧妙研發(fā)的GOTI (genome-wide offtarget analysis by two-cell embryo injection，GOTI)檢測(cè)體系，完美地解決了上述的實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì)與技術(shù)上的問題。

楊輝是基因編輯領(lǐng)域的專家，曾發(fā)表通過CRISPR/Cas9技術(shù)一步法構(gòu)建多基因突變小鼠的重要成果[6]，也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物胚胎構(gòu)建實(shí)驗(yàn)專家，在博士階段就發(fā)表了人造精子的重大突破成果。此次他帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)巧妙地借助了胚胎發(fā)育的規(guī)律。一個(gè)小鼠受精卵發(fā)育過程中經(jīng)過多次增殖分裂，在發(fā)育至二細(xì)胞卵裂球時(shí)，這兩個(gè)細(xì)胞理論上遺傳背景是完全一樣的。如圖2所示，對(duì)其中一個(gè)卵裂球進(jìn)行基因編輯并使之帶上紅色熒光蛋白標(biāo)記，另一個(gè)就成了最佳對(duì)照。等胚胎繼續(xù)發(fā)育至14.5天，將整個(gè)胚胎消化，通過流式細(xì)胞儀分選出編輯與未編輯的兩組細(xì)胞。再通過全基因組深度測(cè)序直接比較兩組細(xì)胞基因組的差異，基本上就可以認(rèn)為是基因編輯造成的。

高彩霞在基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，曾研發(fā)出高效植物堿基編輯器系統(tǒng)(CBE系統(tǒng)BE3，rAPOBEC1-nCas9-D10AUGI)[7]，在學(xué)術(shù)界產(chǎn)生重大影響。此次在水稻開展的研究中，利用其研發(fā)的植物BE3編輯系統(tǒng)，通過設(shè)計(jì)嚴(yán)格的對(duì)照組，有效消除了背景噪音信號(hào)，結(jié)合高精度的全基因組深度測(cè)序，也得到了足夠高的信噪比數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了精密的脫靶檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)以前未曾發(fā)現(xiàn)的大量突變。

在確保靶位點(diǎn)編輯效率的情況下，通過全基因組深度測(cè)序分析，兩篇論文都得出一致結(jié)論，將脫靶原因的矛頭指向胞嘧啶編輯器。研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)：插入/缺失突變率都很低且各組之間差異不大，但SNVs在不同系統(tǒng)間差異顯著。如圖3所示，ABE系統(tǒng)沒有顯著SNVs，但CBE，包括早前認(rèn)為高精確性的BE3系統(tǒng)，都會(huì)產(chǎn)生全基因組范圍的大量SNVs。在小鼠中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，ABE組每個(gè)胚胎平均約出現(xiàn)10個(gè)SNVs，這屬于發(fā)育所產(chǎn)生的隨機(jī)突變范圍[8]，而BE3系統(tǒng)產(chǎn)生的SNVs數(shù)量則是ABE組的20倍以上。并且，在小鼠中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，脫靶造成的許多SNVs出現(xiàn)在原癌基因與抑癌基因上。

楊輝團(tuán)隊(duì)還對(duì)經(jīng)典 CRISPR/Cas9與堿基編輯器進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9組單個(gè)胚胎平均只出現(xiàn)12個(gè)SNVs。這表明設(shè)計(jì)良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應(yīng)，由此可結(jié)束長久以來關(guān)于CRISPR/Cas9真實(shí)脫靶率的爭(zhēng)議。

在GOTI的研發(fā)道路上，楊輝團(tuán)隊(duì)面前有很多的險(xiǎn)阻。在研究進(jìn)展很緩慢的情況下，經(jīng)過與所長蒲慕明院士商議，團(tuán)隊(duì)決定繼續(xù)攻堅(jiān)。確實(shí)，由于有著體細(xì)胞克隆猴的輝煌成就，并攻克了國外一流科學(xué)家都認(rèn)為極難實(shí)現(xiàn)的剩下部分，中國這群科學(xué)家有了足夠的底氣和信心，而且，只有解開這個(gè)疑團(tuán)，才能為該技術(shù)的前進(jìn)指明正確方向。

圖2 脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：(a)小鼠GOTI技術(shù)[1]；(b)在水稻中的研究[2]

圖3 研究發(fā)現(xiàn)CBE系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重SNVs脫靶效應(yīng)：(a)(b)在水稻中進(jìn)行的研究[2]；(c)(d)在小鼠中進(jìn)行的研究[1]

值得一提的是，楊輝的博士生導(dǎo)師是取得人造精子重大突破的科學(xué)家、中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松，以及體細(xì)胞克隆科學(xué)家孫強(qiáng)。這兩位都是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳大元的博士生，而陳大元正是我國著名實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)家與中國克隆學(xué)之父童第周先生的弟子，真可謂是一門派獨(dú)步天下。當(dāng)年童老留學(xué)歐洲，徒手剝離蛙卵細(xì)胞膜，震驚整個(gè)歐洲學(xué)術(shù)界，學(xué)成歸國后培育出雙尾金魚——童魚，證明了細(xì)胞質(zhì)中mRNA同樣具有遺傳功能?，F(xiàn)在，楊輝教授他們這幾個(gè)后輩傳承了童老等老一輩的優(yōu)良傳統(tǒng)，苦戰(zhàn)攻堅(jiān)，戰(zhàn)勝一個(gè)個(gè)難題，做到了外國科學(xué)家認(rèn)為不可能的事，取得舉世矚目的重大成就。楊輝教授表示，利用GOTI成果，有望由此開發(fā)出精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標(biāo)準(zhǔn)。

3 尺度衡量嚴(yán)格精準(zhǔn)指明發(fā)展方向

蒲慕明表示：“這能讓我們重新審視基因編輯技術(shù)的安全性，但不是說這項(xiàng)技術(shù)不能再開展基因治療了。正是因?yàn)橐呀?jīng)建立新的檢測(cè)技術(shù)，我們才知道如何去修正、改善BE3，從而開發(fā)安全性更高的新一代基因編輯工具，造?；颊?。”[9]

研究者巧妙構(gòu)建的精密脫靶檢測(cè)技術(shù)，正如一把尺子，可嚴(yán)格精準(zhǔn)地衡量出編輯技術(shù)的質(zhì)量?？吹浇Y(jié)果，更重要的是要尋找出導(dǎo)致這些結(jié)果的原因，才能為后續(xù)研究發(fā)展指明方向。

小鼠脫靶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BE3組出現(xiàn)大部分SNV是G到A突變與C到T突變，水稻研究也發(fā)現(xiàn)絕大部分是C到T突變，反映出SNV是由BE3編輯系統(tǒng)組分脫氨酶rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脫氨酶)所引起。與之前研究發(fā)現(xiàn)rAPOBEC1發(fā)揮功能需要單鏈DNA結(jié)合活性一致[10]。此次發(fā)現(xiàn)脫靶位點(diǎn)也主要出現(xiàn)在基因編碼區(qū)，尤其是高表達(dá)的基因(圖4)。

圖4 小鼠研究中，對(duì)BE3導(dǎo)致的SNVs脫靶的歸類分析。(a)SNVs主要發(fā)生在基因編碼區(qū)；(b)在4細(xì)胞胚胎時(shí)，含SNVs的基因有更高的表達(dá)；(c)不同胚胎鑒定出來的SNV沒有重疊性；(d)GOTI檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的SNVs與CRISPROR/Cas-OFFinder預(yù)測(cè)出來的SNVs的重疊性分析[1]

此次小鼠編輯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著BE3表達(dá)的下降，靶位點(diǎn)的編輯效率也隨之顯著降低。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，BE3編輯器特有的另一組分尿嘧啶糖基化酶抑制劑(uracil glycosylase inhibitor，UGI)也會(huì)顯著增加C到T的突變率[11]。因此，有望通過對(duì)BE3的脫氨酶與UGI組分的優(yōu)化，來解決堿基編輯的脫靶問題。的確，ABE編輯器所采用的是工程化的脫氨酶，缺乏單鏈DNA結(jié)合活性，而且沒加入U(xiǎn)GI，因此不會(huì)造成顯著SNVs的脫靶。

GOTI技術(shù)實(shí)現(xiàn)了非常嚴(yán)格的對(duì)照組設(shè)計(jì)來確定基因突變的位點(diǎn)，因此跳出了傳統(tǒng)脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法的限制。反過來，兩項(xiàng)研究都表明，現(xiàn)有脫靶檢測(cè)技術(shù)都有顯著的局限。

水稻與小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析都發(fā)現(xiàn)，脫靶位點(diǎn)都不能通過現(xiàn)有軟件來進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，脫靶出現(xiàn)的突變位點(diǎn)的連接序列與靶序列并無相似性，脫靶序列與靶序列之間也沒有相似性，這些都與經(jīng)典預(yù)測(cè)方法不一致。小鼠研究表明，即使是BE3組內(nèi)的不同個(gè)體，脫靶位點(diǎn)也沒有序列相似性。這些研究成果都明確提示出，對(duì)基因編輯技術(shù)的安全性評(píng)估值得重新審視，采用現(xiàn)有軟件(如Cas-OFFinder、CRIPOR)來進(jìn)行脫靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)方法也需要修正。

4 破解疑云促人反思

中國學(xué)者的這些成果破解了久懸不決的疑云。在此之前，基因編輯臨床試驗(yàn)卻風(fēng)風(fēng)火火地鋪展開來，接連的試驗(yàn)被批準(zhǔn)。據(jù)2018年7月發(fā)表在《Nature Biotechnology》上的一篇論文顯示，在NIH上首批6項(xiàng)CRISPR技術(shù)編輯的細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)都是中國學(xué)者登記的[12]，其中四川大學(xué)盧鈾領(lǐng)導(dǎo)的項(xiàng)目成為全球首個(gè)啟動(dòng)的該類臨床試驗(yàn)。但其安全性究竟如何？

世界首例基因編輯雙胞胎在中國出生，使基因編輯一度成為公眾街頭巷尾熱議的話題，所引起的風(fēng)波至今仍未平息。中國眾多學(xué)者對(duì)其嚴(yán)厲譴責(zé)，一是因?yàn)槠鋰?yán)重觸犯人類倫理道德底線，再就是其所使用的CRISPR基因編輯技術(shù)的安全性與精確性仍然沒有被嚴(yán)格驗(yàn)證，很可能由于脫靶而導(dǎo)致許多意想不到的后果。科學(xué)必須嚴(yán)謹(jǐn)，在沒有真正確定技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)之前就貿(mào)然進(jìn)行人體試驗(yàn)，對(duì)人類、對(duì)科學(xué)都是極不負(fù)責(zé)的。例如，當(dāng)年某些科學(xué)家貿(mào)然進(jìn)行的基因治療試驗(yàn)，致使患者無辜死亡，研究者鋃鐺入獄，已成為科研史上難以抹去的污點(diǎn)。

為了避免類似悲劇重演，人類在進(jìn)行這些活動(dòng)時(shí)必須要慎之又慎。值得注意的是，對(duì)于人類種系細(xì)胞基因編輯，技術(shù)上通過結(jié)合體外受精(IVF)、胚胎植入前遺傳診斷(preimplantation genetic diagnosis)等方法可篩選出健康胚胎。但是，種系細(xì)胞基因編輯的嚴(yán)重危害，特別是基因編輯所帶來的很多無法預(yù)料的后果，干擾人類基因組的一致性和同質(zhì)性，強(qiáng)烈褻瀆生命的神圣性，這一切對(duì)人類可能就是滅頂之災(zāi)。從人類長遠(yuǎn)的核心利益來看，應(yīng)該堅(jiān)決禁止人類種系細(xì)胞基因編輯。必須牢記，人類的長遠(yuǎn)利益遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于個(gè)別學(xué)者提出的所謂商業(yè)市場(chǎng)價(jià)值。為此，我國開展高風(fēng)險(xiǎn)生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)臨床研究應(yīng)用管理?xiàng)l例公開征求意見，正是出于對(duì)全人類長遠(yuǎn)核心利益的重大關(guān)切而做出的明智之舉。