郭思文 ，趙曉燕，馬越，張敏，趙煜煒，王丹*

1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心、北京市果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100097）；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（沈陽 110866）；3. 龍大食品集團(tuán)有限公司（萊陽 265231）

大蒜屬百合科蔥屬，2年生草本植物。大蒜營養(yǎng)成分非常豐富，含有多種生物活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。迄今為止，在大蒜中已發(fā)現(xiàn)200余種化合物[3]，目前認(rèn)為含硫化合物是主要的生物活性物質(zhì)，主要有二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物等[4]。大蒜色變是蒜制品粗加工過程中常見的現(xiàn)象，打破休眠期的大蒜經(jīng)機(jī)械破碎或一元有機(jī)弱酸處理后發(fā)生色變[5-6]，產(chǎn)生的是一種含氮的花青素類色素[7]。多年來，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對臘八蒜黃色素進(jìn)行研究，但由于反應(yīng)物質(zhì)和色素組成的多樣性和復(fù)雜性，其形成研究仍處于推測層面上，仍需更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明其具體的反應(yīng)歷程。研究發(fā)現(xiàn)，綠色素實(shí)際上由藍(lán)色素和黃色素組成，藍(lán)色素不穩(wěn)定逐漸轉(zhuǎn)化為黃色素[8]。在黃色素提取過程中，很多物質(zhì)如粗蛋白、可溶性糖等溶出至浸泡液，分離難度較大[9]。因此結(jié)合各層析方法的特點(diǎn)，對臘八蒜黃色素進(jìn)行分離純化與鑒定。同時(shí)，臘八蒜黃色素作為一種潛在的色素資源，其穩(wěn)定性是影響其開發(fā)與應(yīng)用的主要因素。

目前對于臘八蒜黃色素研究甚少，結(jié)合前人的研究成果，論述臘八蒜黃色素形成機(jī)制，歸納臘八蒜黃色素分離純化及鑒定的方法與進(jìn)展，并分析影響臘八蒜黃色素穩(wěn)定性因素，以期為中國大蒜的深加工產(chǎn)業(yè)和臘八蒜黃色素的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 臘八蒜黃色素形成的原理

自Cruss發(fā)現(xiàn)加入乙酸的蒜泥會產(chǎn)生綠色素，即大蒜綠變，已有70余年，至今其機(jī)理仍未闡明，而由綠色素轉(zhuǎn)化的臘八蒜黃色素的形成途徑，更是處于推測階段。研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜綠色素不同于葉綠素及其他含卟啉類色素，而是一種含氮的花青素類色素，具有多個(gè)吡咯環(huán)，當(dāng)吡咯環(huán)的聚合度增加時(shí)，其顏色由紫紅向藍(lán)、綠、黃方向改變。隨著蔥屬植物研究的進(jìn)一步深化，發(fā)現(xiàn)洋蔥與大蒜的色變機(jī)制具有驚人的相似之處[10]。

1.1 大蒜的生理特性和處理方法對色變的影響

大蒜在較高溫度下（22 ℃）具有休眠特性，一般為2～3個(gè)月[11]。大蒜的色變與貯藏溫度有關(guān)，貯藏溫度在22 ℃以上可有效防止大蒜在加工過程中色變現(xiàn)象的發(fā)生，新蒜也不會發(fā)生色變，只有在低溫（12 ℃）條件下儲藏一段時(shí)間的蒜才具有色變能力[12-13]，此過程是可逆的。在此期間大蒜中的多種化學(xué)成分發(fā)生變化，定義為大蒜打破休眠的過程。

最早發(fā)現(xiàn)大蒜的色變是在破碎的蒜瓣中，顏色變化過程是藍(lán)→綠→黃。常規(guī)的大蒜色變有2種方式，一是機(jī)械破碎，即蒜泥的綠變，機(jī)械破碎會使存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸亞砜底物與存在于液泡中的蒜酶接觸，從而發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生綠色素。研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜的色變與破碎程度直接相關(guān)，蒜瓣破碎得越細(xì)，色變越快[14]。二是醋酸浸泡，將大蒜鱗莖浸泡在醋酸中，通過改變細(xì)胞膜及液泡膜的通透性，從而使蒜酶與半胱氨酸亞砜接觸，繼而產(chǎn)生綠色素。白冰[6]采用具有與醋酸近似pKa值的一元有機(jī)弱酸（丙酸、丁酸、戊酸等）對大蒜進(jìn)行浸泡處理，發(fā)現(xiàn)都具有使打破休眠期的大蒜變綠的能力，而二元或多遠(yuǎn)有機(jī)弱酸（蘋果酸、檸檬酸等）則不能，這與一元有機(jī)弱酸的pKa值有關(guān)。一元弱酸在達(dá)到解離平衡過程中產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的中性分子，會非特異性地破壞液泡膜，從而產(chǎn)生一系列反應(yīng)。多元有機(jī)酸如蘋果酸和檸檬酸雖然可以改變細(xì)胞膜的通透性，但同時(shí)也是參加三羧酸循環(huán)的重要有機(jī)酸，所以植物細(xì)胞中具有調(diào)控這些多元有機(jī)酸的機(jī)制，從而不會破壞液泡膜，臘八蒜不會變綠。但無論是綠變的蒜泥或是蒜瓣，隨著儲藏時(shí)間延長，色變的過程都是由藍(lán)綠色逐漸向黃色轉(zhuǎn)化。

1.2 大蒜色變過程中化學(xué)成分的變化

在大蒜色變過程中，主要是酶和含硫化合物發(fā)揮作用，伴隨著酶促反應(yīng)和非酶反應(yīng)。大蒜中含有多種酶類，包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、蒜氨酸酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等。在低溫貯藏（打破休眠）期間存在于大蒜鱗莖中的關(guān)鍵的含硫次生代謝產(chǎn)物是一類含硫非蛋白質(zhì)氨基酸，即半胱氨酸亞砜[15-16]，如蒜氨酸、異蒜氨酸、環(huán)蒜氨酸等[17-18]。

研究表明，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）在臘八蒜的變色過程中起到了重要的作用，GGT是生物體中普遍存在的酶，認(rèn)為與次級代謝有關(guān)。江英等[19]發(fā)現(xiàn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的活性與臘八蒜色變的變化是保持一致的，并且在大蒜變色的過程中作為水解酶存在，可以使蒜中的某種γ-谷氨肽水解[20]。由于GGT在低溫下具有較高的活性，因此大蒜在低溫儲藏過程中，GGT可以通過切割γ-谷氨酰肽中的?；糠稚上鄳?yīng)的半胱氨酸[21]，而后在H2O2或氧化酶的作用下生成亞砜類物質(zhì)[22]，如蒜氨酸（1-PeSCO）和異蒜氨酸（2-PeCSO）等[23-24]。研究表明，新鮮大蒜中PeCSO含量很低，經(jīng)低溫貯藏后在GGT的作用下含量升高，作為大蒜色變的重要因素之一，具有使不能色變的大蒜變色的能力，且色變程度與其含量呈正比。但在高溫或堿性條件下，PeCSO會發(fā)生環(huán)化，產(chǎn)生環(huán)蒜氨酸，環(huán)蒜氨酸較為穩(wěn)定[25]，且不參與大蒜的色變過程，這也是高溫下大蒜不能產(chǎn)生色變的原因之一。

蒜氨酸裂解酶是蔥屬植物色變的前提，位于液泡中，具有Cβ-Sγ鍵裂解酶活性。以前的研究表明，由于大蒜中PeCSO和蒜酶分別存在于細(xì)胞的不同部位，因此大蒜的綠化只發(fā)生在加工大蒜中，如蒜泥或臘八蒜。這些處理是通過機(jī)械破碎或一元弱酸改變液泡膜通透性的原理使蒜氨酸裂解酶與細(xì)胞質(zhì)中底物接觸，從而將半胱氨酸亞砜裂解為二丙烯基硫代亞磺酸酯（色素中間體）和烯丙基硫代亞磺酸酯（大蒜素）[26]。

2004年，Kubec等[10]通過體外試驗(yàn)得出洋蔥紅變和大蒜綠變的色變前體都是含丙烯基的硫代亞磺酸酯。2005年，李蕾等[27]發(fā)現(xiàn)大蒜綠變能力同硫代亞磺酸酯含量呈正相關(guān)，此后研究發(fā)現(xiàn)隨臘八蒜綠變程度加深，其內(nèi)部硫代亞磺酸酯含量降低。為進(jìn)一步證明硫代亞磺酸酯直接參與色素形成，向反應(yīng)體系中添加半胱氨酸以消耗硫代亞磺酸酯，最終溶液中并無色素產(chǎn)生，認(rèn)為硫代亞磺酸酯很可能參與色素形成的一系列反應(yīng)。

1.3 臘八蒜黃色素的形成途徑

隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)臘八蒜綠色素實(shí)際上是先生成藍(lán)色素，藍(lán)色素不穩(wěn)定，對光、熱敏感，隨時(shí)間延長分解產(chǎn)生一種比藍(lán)色素相對分子質(zhì)量更小的黃色素，二者綜合呈現(xiàn)出綠色。藍(lán)色素和黃色素的紫外可見吸收峰分別在590和440 nm處[28]。有學(xué)者就臘八蒜黃色素的形成途徑及化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行探討，主要分為兩部分：一是由藍(lán)色素降解得到；二是由中間產(chǎn)物吡咯基氨基酸中間體和丙酮酸反應(yīng)得到黃色素。

低溫貯藏過程中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性增加，催化γ-谷氨酰肽，如γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC）和谷氨酰-S-丙烯基-L-半胱氨酸（GSPC）轉(zhuǎn)化為S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（2-PeCSO）和S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜（1-PeCSO）。大蒜組織破損后，PeCSO在蒜酶的作用下分解為次磺酸和丙酮酸，次磺酸不穩(wěn)定，進(jìn)一步聚合生成相應(yīng)的硫代亞磺酸酯[29]。Imai等[30]通過體外的模式反應(yīng)提出吡咯基氨基酸可能作為大蒜綠變的中間體。經(jīng)進(jìn)一步研究，楠丁呼思勒等[31]發(fā)現(xiàn)在醋泡的新蒜中添加吡咯基纈氨酸后導(dǎo)致新蒜綠變，但游離氨基酸或吡咯則不具備此功能，由此證明吡咯基氨基酸作為大蒜綠變過程中的中間體。因此，丙烯基硫代亞磺酸酯和氨基酸反應(yīng)生成吡咯基氨基酸中間體后，吡咯基氨基酸與烯丙基硫代亞磺酸酯結(jié)合生成藍(lán)色素，藍(lán)色素不穩(wěn)定，降解為黃色素。

Bai等[32]、王丹等[33]通過Paal-Knorr反應(yīng)以6種疏水鏈的氨基酸為原料合成吡咯基氨基酸模型物，通過體外試驗(yàn)與丙酮酸反應(yīng)生成黃色素，該黃色素在418～460 nm范圍內(nèi)具有最大吸收，與臘八蒜黃色素的吸收相似。此外，臘八蒜色變的程度與吡咯基氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)，即模型化合物的側(cè)鏈基團(tuán)越小，產(chǎn)生的黃色素越多。此外，對吡咯基甘氨酸、吡咯基纈氨酸和吡咯基異亮氨酸與丙酮酸產(chǎn)生的黃色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，所產(chǎn)生的黃色素的紫外吸收峰分別在400.9，432.9和433.9 nm處有最大吸收，相對分子質(zhì)量分別為300，384和412，它們都是2個(gè)吡咯環(huán)通過共軛雙鍵的連接聚合而成的[34]。同樣，在吡咯基天冬氨酸與丙酮酸的反應(yīng)中同樣觀察到黃色素的產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)與吡咯基纈氨酸與臘八蒜素產(chǎn)生的色素結(jié)構(gòu)相似[30,35]。由此推測吡咯基氨基酸作為色素前體參與了臘八蒜黃色素的形成，與丙酮酸反應(yīng)生成黃色素，且產(chǎn)生的黃色素結(jié)構(gòu)相似。

2 臘八蒜黃色素分離純化及結(jié)構(gòu)表征

臘八蒜浸泡液或蒜泥長時(shí)間放置會變?yōu)辄S色，對黃色素進(jìn)行分離純化并鑒定其結(jié)構(gòu)對于臘八蒜黃色素的形成機(jī)理至關(guān)重要。目前通常采用柱層析、高效液相色譜法對臘八蒜黃色素進(jìn)行分離提純，并采用高分辨率質(zhì)譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定分析。

趙曉丹等對臘八蒜綠色素提取溶劑的選擇、色素的極性、分離介質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，水、醋酸等極性較高的溶劑和非極性溶劑對色素的提取效果不佳，甲醇和95%乙醇對色素的提取效果較好，通過萃取溶劑的確定認(rèn)為色素屬于中等極性的物質(zhì)。趙曉丹還對比了強(qiáng)離子交換樹脂、弱離子交換樹脂及不同極性的大孔吸附樹脂，發(fā)現(xiàn)色素易于被極性樹脂吸附，SIPI-40樹脂對色素的吸附率最高。已知臘八蒜綠色素為黃色素和藍(lán)色素的混合物，因此在此基礎(chǔ)上建立提取分離臘八蒜黃色素的方法，根據(jù)色素極性采用甲醇作為黃色素提取溶劑，經(jīng)真空濃縮除去甲醇后，得到乳狀色素提取液，使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。而后經(jīng)大孔吸附樹脂SIPI-40、Sephadex LH-20凝膠層析和C18固相微萃取分離精制，再通過高效液相色譜進(jìn)一步分離，得到臘八蒜黃色素。

司君偉[36]研究發(fā)現(xiàn)，得到的黃色素并非一種物質(zhì)，而是由不同黃色素組成，推斷黃色素可能含有183 Da的物質(zhì)，但對于提取出的物質(zhì)沒有進(jìn)一步解離及電子轟擊進(jìn)行鑒定。另外，在使用Amberlite CG-50分離藍(lán)色素時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分黃色素也被洗脫下來，由此得到黃色素與藍(lán)色素的極性相似，且相對分子質(zhì)量小于藍(lán)色素，推測這部分黃色素可能是藍(lán)色素向黃色素轉(zhuǎn)化的最初黃色素形態(tài)。

Wang等[7]在模擬體系中使用吡咯基甘氨酸、吡咯基纈氨酸、吡咯基異亮氨酸分別與丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生黃色素，通過固相微萃取、液質(zhì)聯(lián)機(jī)、高分辨率質(zhì)譜、多級質(zhì)譜分離純化鑒定此色素，闡明其分子組成并推測化學(xué)結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜碎片裂解機(jī)理及形成機(jī)理。其中吡咯基甘氨酸與丙酮酸產(chǎn)生2種黃色素，紫外吸收光譜分別為436.9和400.9 nm，相對分子質(zhì)量分別為328和300，相應(yīng)的分子式為C18H20N2O4和C16H16N2O4，都是兩摩爾的2-吡咯基乙酸通過共軛雙鍵的連接聚合生成的，但相對分子質(zhì)量328的色素較相對分子質(zhì)量為300的在連接兩摩爾的吡咯基甘氨酸的基團(tuán)上多了2個(gè)甲基。由吡咯基纈氨酸和吡咯基異亮氨酸與丙酮酸反應(yīng)產(chǎn)生的黃色素的紫外吸收光譜分別為432.9和433.9 nm，相對分子質(zhì)量分別為384和412，相應(yīng)的分子式為C22H28N2O4和C24H32N2O4，是兩摩爾的吡咯基纈氨酸或兩摩爾的吡咯基異亮氨酸通過共軛雙鍵的連接聚合生成的。

國內(nèi)外對于臘八蒜黃色素這種未知結(jié)構(gòu)的色素研究較少，Wang等[7]通過人工合成的黃色素結(jié)構(gòu)的鑒定，進(jìn)一步證實(shí)前人提出的吡咯基氨基酸作為“臘八蒜”色素中間體這一假設(shè)的正確性，并為今后研究真實(shí)體系中黃色素形成奠定基礎(chǔ)。

3 臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的研究進(jìn)展

臘八蒜黃色素作為天然色素，在提取和應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性備受關(guān)注。白冰[6]在蒜泥浸提液中發(fā)現(xiàn)，黃色素在常溫（25 ℃）儲藏期間其吸光度呈先上升后下降趨勢。隨著研究深入，趙曉丹等[37]對于臘八蒜黃色素的穩(wěn)定性進(jìn)行探討。

3.1 溫度

研究發(fā)現(xiàn)，臘八蒜黃色素對熱敏感，熱處理時(shí)溫度越高，色素?fù)p失越大。研究表明，加熱處理會加快臘八蒜藍(lán)色素向黃色素的轉(zhuǎn)化[38]。高溫（大于80 ℃）加熱，會使黃色素受到較大破壞。

3.2 pH

臘八蒜黃色素在酸性條件下較為穩(wěn)定，但過酸（pH＜3）或偏中性條件會加快色素分解，堿性條件下色素分解得更快。趙曉丹等[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)把堿性的色素溶液用酸溶液重新調(diào)至酸性pH時(shí)，色素變化具有可逆性，但吸光度有所降低。這可能是由于pH的改變影響色素的呈色基團(tuán)結(jié)構(gòu)，從而使色素的顯色受影響，并且這種影響是可逆的。

3.3 光照

很多天然色素在自然光照射下會褪色，研究發(fā)現(xiàn)臘八蒜黃色素?fù)p失率隨著光照時(shí)間增加緩慢增加。30 d后，經(jīng)光照處理的黃色素的損失率約9.3%，未經(jīng)光照的黃色素?fù)p失率約為4%。由此可見，光照對臘八蒜黃色素穩(wěn)定性有一定影響，但影響不大。

3.4 氧化劑和還原劑

過氧化氫和亞硫酸鈉作為一種常見的強(qiáng)氧化劑和還原劑，以不同濃度與臘八蒜黃色素溶液混合，反應(yīng)一段時(shí)間后，臘八蒜黃色素吸光度顯示出一定的劑量依賴性。在過氧化氫和亞硫酸鈉濃度為1.5%時(shí)，臘八蒜黃色素的損失率分別達(dá)到22.8%和81.4%，由此可見，氧化劑和還原劑都會嚴(yán)重影響臘八蒜黃色素的穩(wěn)定性。

3.5 金屬離子

一些具有金屬離子活性的副族金屬離子也會影響色素的穩(wěn)定性，使色素發(fā)生褪色或沉淀[39]。在酸性條件下向臘八蒜黃色素溶液中加入不同的金屬離子，發(fā)現(xiàn)Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+，F(xiàn)e2+對黃色素的穩(wěn)定性無顯著影響，而加入Fe3+的黃色素吸光度略有增加。

3.6 食品添加劑

天然色素穩(wěn)定性普遍較差，使用食品中常用的抗氧化劑維生素C和防腐劑山梨酸鉀添加到臘八蒜黃色素中，以期在實(shí)際生產(chǎn)中將食品添加劑應(yīng)用于臘八蒜黃色素中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在維生素C的存在下，臘八蒜黃色素隨放置時(shí)間延長，其損失率不斷增加。而添加山梨酸鉀（添加量＜1%）對黃色素?zé)o顯著影響。由此說明在臘八蒜黃色素過程中應(yīng)盡量避免使用維生素C，可以適量與山梨酸鉀共用。

因此，臘八蒜黃色素應(yīng)盡量處于低溫、避光、酸性條件下進(jìn)行貯藏，并避免與維生素C、氧化劑和還原劑接觸。色素的穩(wěn)定性對于開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要，目前對于提高臘八蒜黃色素穩(wěn)定化方法研究較少。天然色素常采用色素穩(wěn)定劑、酰基化改造和微膠囊化技術(shù)等[40-42]提高穩(wěn)定性，對于提高臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的調(diào)控技術(shù)以及進(jìn)一步應(yīng)用還有待探討。

4 展望

雖然目前對于臘八蒜黃色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及形成途徑是通過模擬體系推測得出，但通過模擬體系合成黃色素的方法對研究真實(shí)體系中的臘八蒜黃色素具有重要意義。另外，就臘八蒜黃色素穩(wěn)定性的研究表明，黃色素的穩(wěn)定性較好，具有一定的應(yīng)用可能性。在此基礎(chǔ)上未來可以考慮對臘八蒜黃色素進(jìn)行開發(fā)利用，明確其生物活性和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，為功能性天然色素的開發(fā)利用及大蒜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。