李寧慧 李凌峰 金志華

(浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，寧波 315100)

頭孢菌素類抗生素具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、耐β-內(nèi)酰胺酶、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是臨床治療細(xì)菌性感染的重要藥物[1]。迄今為止，頭孢菌素類抗生素全球已上市了50多個(gè)品種，占抗感染藥物市場(chǎng)的50%，是目前世界上銷售額最大的抗生素之一[2]。我國(guó)自20世紀(jì)70年代生產(chǎn)第一代頭孢菌素產(chǎn)品以來(lái)，已有40多種頭孢菌類抗生素用于臨床。而與全球市場(chǎng)中頭孢菌素類抗生素銷售額逐漸減緩的趨勢(shì)不同，近年來(lái)國(guó)內(nèi)頭孢菌素類抗生素產(chǎn)品正處于快速增長(zhǎng)期，銷售額年增長(zhǎng)率超過(guò)30%，超過(guò)了國(guó)內(nèi)醫(yī)藥產(chǎn)品的平均增長(zhǎng)速率，未來(lái)幾年頭孢菌素原料藥可能會(huì)出現(xiàn)更大競(jìng)爭(zhēng)[3-5]。因此，關(guān)于頭孢菌素類抗生素發(fā)現(xiàn)、生產(chǎn)和應(yīng)用的研究方興未艾。

頭孢菌素C(cephalosporin C,CPC)是頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)的代謝產(chǎn)物。雖然CPC的抗菌活力低于青霉素G，但由于其毒性和過(guò)敏性較低，可作為合成7-氨基頭孢烷酸的前體，生產(chǎn)多種低毒、廣譜和高效的新型頭孢菌素類抗生素。因此，不少學(xué)者對(duì)頭孢菌素C的發(fā)酵條件研究，取得了顯著的成果[6-10]。本課題組進(jìn)行了頭孢菌素C合成菌株的篩選研究，獲得了一株高產(chǎn)頭孢菌素C的頂頭孢霉；由于該菌株的頭孢菌素C產(chǎn)量顯著高于已報(bào)道的菌株的產(chǎn)量，對(duì)該菌株產(chǎn)頭孢菌素C的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，以提高頭孢菌素C的發(fā)酵產(chǎn)量，并豐富對(duì)頂頭孢霉代謝和頭孢菌素C發(fā)酵研究的認(rèn)識(shí)，為深入揭示頂頭孢霉中頭孢菌素C的合成機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制提供信息[11]。

由于影響頂頭孢霉發(fā)酵生產(chǎn)頭孢菌素C的因素較多，為了不遺漏關(guān)鍵的因素，以及諸因素間可能的交互效應(yīng)，同時(shí)為了提高研究的效率，在實(shí)驗(yàn)中采用了Plackett-Burman法和響應(yīng)面方法進(jìn)行了研究。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)(以下文中簡(jiǎn)稱PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))，能從眾多變量中快速篩選出重要的因素；響應(yīng)面方法(response surface methodology,RSM)能將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模綜合起來(lái)，給出指標(biāo)和因素的關(guān)系式，從而得到準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[12]。近年來(lái)，PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、RSM等統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法越來(lái)越受到重視，在各行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，尤其是微生物發(fā)酵條件優(yōu)化的研究中[13-16]。本文從大量菌株中篩選出頂頭孢霉高產(chǎn)菌株，采用響應(yīng)面法對(duì)頭孢菌素C液體發(fā)酵中的各因素進(jìn)行考察及評(píng)價(jià)，在搖瓶中對(duì)頭孢菌素C的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)放大培養(yǎng)提供了可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

頂頭孢霉(Cephalosporium acremonium)，實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：燕麥片24，麥芽糖10，酵母提取物1，瓊脂粉20，Na2SO41，pH6.4。

一級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：黃豆餅粉30，金槍魚(yú)浸膏20，玉米漿7.5，蔗糖5，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：工業(yè)花生餅粉28，黃豆餅粉28，金槍魚(yú)浸膏20，玉米漿15，蔗糖25，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：工業(yè)花生餅粉24，金槍魚(yú)浸膏20，玉米漿13，DL-蛋氨酸7，玉米粉20，果葡糖漿35，工業(yè)小麥面筋粉38，(NH4)2SO48，CaSO412，CaCO334，豆油0.1，pH7.2。

以上培養(yǎng)基1×105Pa滅菌30min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頂頭孢霉菌的篩選

取1mL的10%甘油孢子懸浮液稀釋，分別取稀釋為10-1、10-2和10-3的菌懸液各0.1mL涂布于培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)3～4d至單菌落出現(xiàn)，菌落長(zhǎng)到1～2mm，挑選白色、菌落直徑大、隆起高、沒(méi)有裂縫的單菌落接種一級(jí)種子培養(yǎng)液，在28℃，190r/min的搖床培養(yǎng)4d。取一級(jí)種子培養(yǎng)液，用生理鹽水稀釋10倍，然后取1mL，加入二級(jí)種子瓶中，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速：210r/min，培養(yǎng)溫度：28℃，培養(yǎng)時(shí)間：4d。取2mL二級(jí)種子培養(yǎng)液，加入含1.5mL豆油和10mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速：280r/min，溫度：28℃，培養(yǎng)7d。取發(fā)酵液測(cè)定頭孢菌素含量，篩選高產(chǎn)菌株并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 頭孢菌素C的液體發(fā)酵

將篩選得到的高產(chǎn)菌株經(jīng)活化后，分別接種于一級(jí)、二級(jí)種子液中培養(yǎng)，取一定稀釋倍數(shù)的二級(jí)種子液接種至經(jīng)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于選定溫度下，轉(zhuǎn)速為280r/min的搖床培養(yǎng)7d后測(cè)定培養(yǎng)基中頭孢菌素C含量。

1.2.3 頭孢菌素C的濃度測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定[6]。發(fā)酵液中頭孢菌素的提?。河枚ㄐ詾V紙過(guò)濾發(fā)酵液，吸取1mL上清液，再加入4mL甲醇和5mL純水，充分搖勻，再取1mL與稀釋液與9mL純水混合，搖勻后用0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾備用[11]。

1.3 頭孢菌素C發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選重要影響因素

PB設(shè)計(jì)是一種二水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，主要通過(guò)對(duì)每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，即以“+”、“-”分析，低水平一般為原始水平，高水平一般為原始水平的1.5倍左右，但主要還是視具體實(shí)驗(yàn)情況而定。它以N次實(shí)驗(yàn)來(lái)考察最多N-1個(gè)變量，還應(yīng)留足空項(xiàng)(或稱虛擬變量)用于方差分析。在N次的PB實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)變量的“高”、“低”水平分別出現(xiàn)N/2次，可計(jì)算出此因素的效應(yīng)，當(dāng)某個(gè)因素處于“高”、“低”水平時(shí)，其余因素均出現(xiàn)N/4次，其他因素的效用將正負(fù)抵消而消除。對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析，并通過(guò)F檢驗(yàn)進(jìn)行效應(yīng)顯著度的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)[17]。本實(shí)驗(yàn)考察11個(gè)影響因素，余留4個(gè)空項(xiàng)，所以選用N=16的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1安排實(shí)驗(yàn)，各代號(hào)對(duì)應(yīng)的實(shí)際變量“+”、“-”和水平相應(yīng)的真實(shí)值見(jiàn)表2。

1.3.2 最陡坡試驗(yàn)

最陡坡法也叫最陡(速)上升法(method of steepest ascent)，是一種多因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法。首先用正交試驗(yàn)查找最陡坡，使各因素水平的變動(dòng)幅度與各自效應(yīng)的大小成比例；然后沿最陡方向即目標(biāo)相應(yīng)升高方向安排一批試驗(yàn)點(diǎn)，根據(jù)響應(yīng)目標(biāo)對(duì)該效應(yīng)的敏感度確定步長(zhǎng)，調(diào)節(jié)至實(shí)驗(yàn)指標(biāo)最優(yōu)化；最后以最優(yōu)點(diǎn)為中心安排實(shí)驗(yàn)[18]，檢驗(yàn)頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)量的最高區(qū)域。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)論，安排最陡坡實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3。此法可明顯減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，縮短實(shí)驗(yàn)周期。

1.3.3 中心復(fù)合試驗(yàn)

中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的模型[17]。通過(guò)最陡坡實(shí)驗(yàn)確定頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)量最高區(qū)域后，選用中心復(fù)合設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4，各因素及其水平見(jiàn)表5。利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表4中數(shù)據(jù)擬合得到一個(gè)二階數(shù)學(xué)模型，求解得到最高頭孢菌素C產(chǎn)量最優(yōu)化發(fā)酵條件，由三維響應(yīng)面圖直觀顯示出優(yōu)化結(jié)果。

1.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)頭孢菌素C產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，安排在該預(yù)測(cè)之下的最優(yōu)發(fā)酵條件，比較真實(shí)值和預(yù)測(cè)值，確定優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂頭孢霉的篩選

從分離平板中選出了18個(gè)白色、隆起高、菌落直徑大、沒(méi)有裂縫的單菌落，編號(hào)1～18，將單菌落的一半準(zhǔn)備接種到種子培養(yǎng)基中，另一半接種至斜面培養(yǎng)基上保藏菌種。

取對(duì)應(yīng)的菌株編號(hào)轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)液中，再經(jīng)一級(jí)、二級(jí)種子液培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵7d后取樣測(cè)定頭孢菌素C的含量。從甘油孢中篩選得到一株頂頭孢霉高產(chǎn)菌G3-7，發(fā)酵液中的頭孢菌素C含量達(dá)到32.59g/L。與已報(bào)道的多株產(chǎn)頭孢菌素C的頂頭孢霉相比，該菌株的頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)量較高[6-10]，表明該菌株在代謝性能、特別是頭孢菌素C合成代謝途徑方面，具有與已報(bào)道菌株不同的特征，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

2.2 頂頭孢霉液體發(fā)酵條件優(yōu)化研究

表1 Plackett-Burman的實(shí)驗(yàn)與結(jié)果(N=16)Tab.1 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 16 trials

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素水平、效應(yīng)Tab.2 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design

表3 最陡坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Experimental design of steepest ascent and the corresponding results

表4 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Tab.4 Experimental design and the actual and predicted values of cephalosporin C by CCD

表5 中心復(fù)合設(shè)計(jì)因素變量及其水平Tab.5 Levels and code of variables for CCD

2.2.1 影響頂頭孢霉液體發(fā)酵的重要因素

由表2中P值大小可知，金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸濃度是對(duì)頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)量有顯著影響的重要因素：前者存在顯著的正效應(yīng)，濃度需進(jìn)一步增加；后者存在顯著的負(fù)效應(yīng)，當(dāng)前使用濃度過(guò)高，應(yīng)適當(dāng)降低。玉米漿和花生餅粉濃度以及發(fā)酵溫度也有一定的影響，而培養(yǎng)基中的其它成分，如果葡糖漿等的濃度以及pH值、裝液量、接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量均無(wú)顯著影響。這說(shuō)明對(duì)于高產(chǎn)菌株G3-7發(fā)酵產(chǎn)生頭孢菌素C的過(guò)程而言，金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸是兩種重要的營(yíng)養(yǎng)要素。金槍魚(yú)浸膏的主要成份是魚(yú)蛋白酶解而成的短肽鏈，富含20多種氨基酸、多種B族維生素、有機(jī)微量礦物質(zhì)、牛磺酸和不飽和脂肪酸等物質(zhì)，不僅可以為菌株的生長(zhǎng)和代謝提供氮源、維生素和不飽和脂肪等營(yíng)養(yǎng)要素，而且其中的有機(jī)微量礦物質(zhì)有助于提高菌體內(nèi)相關(guān)代謝酶的活力，促進(jìn)頭孢菌素C合成途徑的活力，進(jìn)而有助于頭孢菌素C的合成。本研究后期采用國(guó)內(nèi)海產(chǎn)品加工廠廢角料生產(chǎn)的魚(yú)精膏代替進(jìn)口金槍魚(yú)浸膏，兩者相比，頭孢菌素C產(chǎn)量基本相當(dāng)，但魚(yú)精膏更加便宜。蛋氨酸在誘導(dǎo)頭孢菌素C的合成過(guò)程中不僅是硫的供應(yīng)者，還有一些其他重要作用，不能被其他化合物所取代，可能原因包括：1)誘導(dǎo)擴(kuò)環(huán)酶，環(huán)化酶，ACV合成酶等；2)為合成頭孢菌素C所需的半脫氨酸提供硫原子[19]。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)基中金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸的濃度進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化研究。

2.2.2 最陡坡試驗(yàn)

為了保證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，首先采用最陡坡實(shí)驗(yàn)法對(duì)金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸濃度進(jìn)行了搜索，以確定存在極值的區(qū)域。根據(jù)表2中這二因素的水平、效應(yīng)值，確定其變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行最陡坡試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

顯然，實(shí)驗(yàn)4的頭孢菌素C產(chǎn)量最高，為35.91g/L。根據(jù)響應(yīng)面CCD實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，選取頭孢菌素C液體發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件即第4組實(shí)驗(yàn)為中心點(diǎn)設(shè)計(jì)。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

根據(jù)最陡坡實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面變量逼近最大產(chǎn)量區(qū)域，以最陡坡實(shí)驗(yàn)中的4號(hào)配方為中心點(diǎn)用中心復(fù)合法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)成2因素5水平，表4是2因素的編碼及取值，表5是試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-expert 8.0軟件，二次多項(xiàng)式回歸得到的二次經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑椋侯^孢菌素C的產(chǎn)量(g/L)=35.82-0.11A+0.56B-0.71AB-1.99A2-0.54B2。

模型整體方差分析(表6)表明：F值為41.532，P＜0.001，說(shuō)明模型是成立的，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型決定系數(shù)為0.967，說(shuō)明響應(yīng)值的變化96.7%來(lái)源于所選因素，模型擬合良好。此外，方差分析中的變異系數(shù)、信噪比均反映數(shù)據(jù)合理，模型的可信度高，可重復(fù)性好，精確度高，能準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此可以認(rèn)為該經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂脕?lái)預(yù)測(cè)頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)量。對(duì)擬合的方程求解得：當(dāng)金槍魚(yú)浸膏為34.32g/L、蛋氨酸為6.52g/L時(shí)，頭孢菌素C的產(chǎn)量為35.99g/L。圖1是金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸影響頭孢菌素C產(chǎn)量的響應(yīng)面圖及等高線。

在已有對(duì)頂頭孢霉發(fā)酵制備頭孢菌素C的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵水平存在顯著影響的關(guān)鍵因素為碳源、氮源和磷源等因素。雖然表2顯示蛋氨酸濃度呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，但其原因在于培養(yǎng)基中添加的蛋氨酸濃度較高(10.5g/L)，因?yàn)樵谇捌趩我蛩貎?yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，添加蛋氨酸可以顯著增加頭孢菌素C的發(fā)酵水平。之所以在PB實(shí)驗(yàn)中蛋氨酸濃度過(guò)高，這可能與多因素之間的交互效應(yīng)有關(guān)。經(jīng)最陡坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面方法建模，表明在培養(yǎng)基中添加6.5g/L的蛋氨酸有助于頭孢菌素C的合成，與文獻(xiàn)報(bào)道用量基本一致[19]。蛋氨酸的主要生理作用是提供一碳單位，參與核酸等多種物質(zhì)的合成，并且具有抗氧化功能。因此，蛋氨酸有可能通過(guò)提供一碳單位的作用，參與頭孢菌素C的合成或其調(diào)控，此外，蛋氨酸中還含有硫元素，這也可能是蛋氨酸影響頭孢菌素C合成的一個(gè)原因。桑美納等[7]在進(jìn)行頭孢菌素C補(bǔ)料發(fā)酵優(yōu)化研究中，之所以選擇硫酸銨而不是氨水，其原因在于前者不僅可以提供氮源，而且還能為CPC合成提供硫源。因此，蛋氨酸增加頭孢菌素C發(fā)酵的產(chǎn)量的原因一方面可能與其提供的一碳單位有關(guān)，另一方面還與其提供的硫元素有關(guān)。但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表6 二次模型回歸方程系數(shù)的方差分析Tab.6 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖1 金槍魚(yú)浸膏和蛋氨酸影響頭孢菌素C產(chǎn)量的響應(yīng)面圖及等高線Fig.1 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the yield of cephalosporin C production

2.3 優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果檢驗(yàn)

在此條件下驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的可靠性，選擇最優(yōu)發(fā)酵條件，以此條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，頭孢菌素C的平均產(chǎn)量為35.946g/L，與理論預(yù)測(cè)值較為接近，誤差小于5%。驗(yàn)證證明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況，可應(yīng)用于頂頭孢霉發(fā)酵條件優(yōu)化。優(yōu)化后頭孢菌素C的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了10.4%。

3 結(jié)語(yǔ)

利用自然篩選的方法分離頂頭孢霉菌的策略，分離得到一株高產(chǎn)頭孢菌素C的菌株，在培養(yǎng)基中添加蛋氨酸可增加該菌株的頭孢菌素C合成，產(chǎn)量達(dá)到32.59g/L。采用PB設(shè)計(jì)方法及響應(yīng)面法相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)頭孢菌素C液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：金槍魚(yú)浸膏34.32、DL-蛋氨酸6.52、花生餅粉24、玉米漿13、玉米粉20、果葡糖漿35、工業(yè)小麥面筋粉38、(NH4)2SO48、CaSO412、CaCO334、豆油0.1，pH7.2，在此條件下的頭孢菌素C產(chǎn)量達(dá)到了35.99g/L。實(shí)驗(yàn)表明，響應(yīng)面法對(duì)于縮短頭孢菌素C液體發(fā)酵試驗(yàn)周期，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)都有很好的作用。此法求得回歸方程精度高，可考察各因素間的交互作用，是研究初期優(yōu)化加工條件、降低開(kāi)發(fā)成本、提高產(chǎn)物產(chǎn)量等實(shí)際問(wèn)題的一種有效辦法。