劉 青，鄧慧敏，周林濤，周義文，黃 榮

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳 518100)

卵巢癌在女性生殖器惡性腫瘤中的發(fā)生率占第3位，但其死亡率卻居第1位[1]，卵巢癌轉(zhuǎn)移是卵巢癌高復(fù)發(fā)與高死亡率的主要原因。miR-135b在不同癌癥中發(fā)揮癌基因功能，與宮頸癌、前列腺癌[2]、子宮內(nèi)膜癌[3]等多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。LI等[4]人構(gòu)建過表達(dá)miR-135b的肝癌細(xì)胞株，通過尾靜脈注入小鼠，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移。與對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-135b的腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著增加，表明miR-135b不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。然而miR-135b在卵巢癌中的作用未見報(bào)道，在此研究中，采用RT-PCR法檢測(cè)miR-135b在卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)，并分析其與卵巢癌患者年齡、組織學(xué)類型、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年1月～2017年12月在解放軍第一七四醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院接受手術(shù)的卵巢病變患者的卵巢組織，包括28例卵巢癌組織(20例漿液性囊腺癌，8例黏液性腺癌)，所有組織均通過病理確認(rèn)并儲(chǔ)存在-80℃以備后用。所有患者手術(shù)前均未經(jīng)激素和放化療治療，且未并發(fā)其它腫瘤。年齡38～67歲，平均年齡55.6±5.1，≥50歲19例，<50歲9例。FIGO臨床分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例；15例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，13例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；高分化8例，中低分化20例。同期收集10例卵巢良性腫瘤組織(漿液性囊腺瘤，黏液性囊腺瘤，畸胎瘤，卵巢纖維瘤，卵泡膜細(xì)胞瘤)作為對(duì)照組，所有組織均經(jīng)病理證實(shí)為良性，-80℃中保存?zhèn)溆?。年齡30～65歲，平均年齡50.2±5.8。

1.2 試劑和儀器 CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，ARKTIK96 PCR儀購(gòu)自Thermo公司；RNA提取試劑盒，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自杭州博日公司。RT-PCR的引物設(shè)計(jì)：使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)U6和has-mir-135b的引物序列：U6：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3’，has-mir-135b-5p：5’-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3’。引物由華大公司合成，干粉離心后用DEPC配成水溶液，濃度為20 μmol/L，放入-20℃冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取和純度檢測(cè)：依據(jù)RNA提取試劑盒說明書從卵巢良性腫瘤組織和卵巢癌組織中提取總RNA。純度檢測(cè)：紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，A260/A280的比值1.80∶2.20，說明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。

1.3.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測(cè)miR-135b：按miRNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(RT-PCR)試劑盒說明書(一步法)對(duì)樣本總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。以2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)時(shí)PCR總體系為25 μl。2.5 μl 10 ×RT-PCR Buffer(含30 mmol/L的Mg2+)，4.0 μl dNTPMixture(2.5 mmol/L)，1 μl RNase inhibitor(40 U/μl)，1 μl上游特異性引物(5 μmol/L)，1 μl下游特異性引物(5 μmol/L)，0.5 μl AMV reverse transciptase，0.5 μl Taq DNA polymerase，RNase free H2O。反應(yīng)條件：95℃ 30s，95℃ 5 min，60℃ 30s，總共40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)各模板的Ct值。

2結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中miR-135b的表達(dá)分析 運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)28例卵巢癌組織中miR-135b的表達(dá)量(1.90±0.53)，與10例卵巢良性腫瘤組織中miR-135b的表達(dá)量(1.45±0.45)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.03，P=0.021)。

2.2 卵巢癌患者不同臨床病理特征間miR-135b表達(dá)的差異分析 見表1。

臨床特征nmiR-135b表達(dá)量t值P值年齡(歲) ≥50 <50組織學(xué)類型 漿液性囊腺癌 黏液性腺癌分化程度 高分化 中低分化臨床分期 <Ⅲ ≥Ⅲ淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú) 有199208820111713151.97±0.511.77±0.571.96±0.501.77±0.611.55±0.252.05±0.541.60± 0.492.10± 0.461.68±0.442.10±0.530.846 0.743 6.104 7.517 5.0360.366 0.396 0.020 0.011 0.034

不同年齡、不同組織學(xué)類型miR-135b的表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.743～0.846，均P>0.05)；不同的分化程度、臨床分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miR-135b的表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.036～7.517，均P<0.05)。

3討論近幾年，對(duì)于非編碼RNA在各種生理過程和病理過程中的作用研究持續(xù)增加，短鏈非編碼RNA(如siRNAs，microRNAs)的研究不斷深入，他們?cè)谏顒?dòng)中的重要意義逐漸被揭示。成熟的microRNA通過與mRNA的3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合而參與基因翻譯及以后的調(diào)控，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制，阻礙蛋白翻譯或降解靶mRNA。最新研究報(bào)道小囊泡及外泌體(exosomes)可通過胞膜融合產(chǎn)生內(nèi)吞作用，其內(nèi)可能含有mRNA和miRNA，被傳送到其他細(xì)胞并發(fā)揮功能，這種miRNAs的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移方式，可作為一種新的基因交流機(jī)制。miRNA-mRNA間可產(chǎn)生類siRNA作用裂解靶mRNAs，通常miRNA只能調(diào)控其1.5～4倍量的靶mRNA表達(dá)，因此只有表達(dá)量充裕的miRNA，才擁有充足的與靶基因結(jié)合的位點(diǎn)，充當(dāng)調(diào)控機(jī)制中“閘門”的作用[5]。miRNA與mRNA間的調(diào)控機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等多方面生物學(xué)過程[6-7]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。例如，miR-182在卵巢癌組織中高表達(dá)，且體外通過靶向作用于FOXO3，MTTS1等腫瘤抑制因子促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)化[8]，同時(shí)體內(nèi)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移[9]。CHENG等[10]人發(fā)現(xiàn)miR-199通過抑制CD44的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，同時(shí)減輕癌細(xì)胞的耐藥性。這些結(jié)果說明miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

miRNA-135分子簇在識(shí)別靶mRNA關(guān)鍵區(qū)域時(shí)可共享其類似序列，尤其是在種子序列區(qū)，miRNA-135a與miRNA-135b作為一個(gè)家族共同參與調(diào)控靶mRNA[11]。miR-135b基因位于染色體1號(hào)長(zhǎng)臂的3區(qū)2號(hào)帶的第1個(gè)亞帶(1q32.1)，它在各種腫瘤中升高，例如骨肉瘤、淋巴瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌等。miR-135b在非小細(xì)胞肺癌中，通過激活Hippo信號(hào)通路和靶向LZTS促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。我們的初步研究發(fā)現(xiàn)miR-135b在卵巢癌組織中高表達(dá)，與卵巢良性腫瘤組織比較結(jié)果有差異(P<0.05)，并且其與卵巢癌分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究結(jié)果提示miR-135b在卵巢癌中高表達(dá)，可能發(fā)揮癌基因功能。

了解卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)卵巢癌的防治至關(guān)重要，但目前與其相關(guān)的機(jī)制尚未闡明。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞表型進(jìn)入間質(zhì)細(xì)胞的過程，繼而使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加[12]。EMT是上皮腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲的重要生物學(xué)過程，在癌癥耐藥中起著相當(dāng)重要的作用[13-14]，是原位癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的一種重要機(jī)制。因此，能否通過內(nèi)源性的控制EMT過程進(jìn)行精細(xì)地、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，是我們希望達(dá)到的目標(biāo)。本課題下一步的研究計(jì)劃是通過靶基因預(yù)測(cè)軟件尋找miR-135b下游的靶點(diǎn)，特別是與EMT調(diào)控相關(guān)的基因，分析卵巢癌患者血清中miR-135b與腫瘤標(biāo)志物CA125之間的關(guān)系，并在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平加以驗(yàn)證，開展作用機(jī)制方面的研究，為確定miR-135b成為腫瘤診斷和治療的重要生物學(xué)指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。