楊迷玲,徐憲偉,張 果,曲青山,楊金花*

(鄭州人民醫(yī)院 1.病理科;2.器官移植科,河南鄭州 450003)

腎移植是腎功能衰竭患者的有效治療手段。目前,移植腎的1年存活率已經(jīng)普遍超過90%,但移植腎的長(zhǎng)期存活狀況并沒有明顯改善[1]。慢性移植腎腎損傷(chronic kidney allograft injury,CAI)是腎移植后常見的并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為移植腎功能進(jìn)行性減退,最終可導(dǎo)致腎功能衰竭。CAI的組織學(xué)特征為非特定因素所致的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。預(yù)防CAI是提高移植腎存活率的主要目標(biāo)之一,有研究認(rèn)為炎癥性巨噬細(xì)胞(M2)與移植腎的間質(zhì)纖維化相關(guān),而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-interstitial transformation,EMT)是腎間質(zhì)纖維化的主要因素,但是M2型巨噬細(xì)胞與移植腎EMT之間的關(guān)系尚不清楚。因此,我們初步用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植腎組織中CD163和EMT標(biāo)記物腫瘤生長(zhǎng)因子(Tumor growth fanctor,TGF-β1)、E-cadherin、Vimentin及SMA蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步分析CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞與移植腎腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 選取鄭州人民醫(yī)院病理科2014-2017年病理診斷為慢性移植腎腎損傷的石蠟標(biāo)本30例,其中男性18例,女性12例,年齡18～53歲。按Banff 2015移植腎活檢診斷標(biāo)準(zhǔn)慢性移植腎腎損傷間質(zhì)纖維化分3級(jí)：Ⅰ級(jí)12例,Ⅱ級(jí)10例,Ⅲ級(jí)8例,用Masson三色染色評(píng)估間質(zhì)纖維化來選取標(biāo)本。同時(shí)收集10例正常腎組織作為對(duì)照組。在選取標(biāo)本時(shí)已除外其他已知原因引起的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮,只選取非特定致病因素引起的間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮,不伴有腎小管炎和動(dòng)脈內(nèi)膜炎。

1.1.2主要試劑 鼠抗人單克隆抗體CD163(克隆號(hào)10D6)、鼠抗人單克隆抗體SMA(克隆號(hào)1A4)、兔抗人多克隆抗體TGF-β1、鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(克隆號(hào)4A2C7)、鼠抗人單克隆抗體Vimentin(克隆號(hào)V9)均購(gòu)自福州邁新公司。

1.2 方法所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定,石蠟包埋,3 μm厚連續(xù)切片,然后用免疫組織化學(xué)EliVision法染色。免疫組化操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。預(yù)處理：CD163、Vimentin和E-cadherin采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 6.0)高溫高壓修復(fù),TGF-β1采用EDTA高溫高壓修復(fù)；SMA無需修復(fù)。經(jīng)DAB顯色,蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化,氨水返藍(lán),脫水,透明,封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照,已知陽性切片作陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定所有結(jié)果由有經(jīng)驗(yàn)的腎臟移植病理醫(yī)師判定。

用Masson三色染色來評(píng)估間質(zhì)纖維化程度,在400倍鏡下,每張切片隨機(jī)選取25個(gè)視野,陽性染色面積占整個(gè)區(qū)域的比值即為纖維化的程度[2]。按Banff 2015[3]移植腎活檢診斷標(biāo)準(zhǔn)分3級(jí)，Ⅰ級(jí)：輕度間質(zhì)纖維化,累及范圍<25%的腎實(shí)質(zhì)；Ⅱ級(jí)：中度間質(zhì)纖維化,累及范圍達(dá)到26%～50%的腎實(shí)質(zhì)；Ⅲ級(jí)：重度間質(zhì)纖維化,累及范圍50%的腎實(shí)質(zhì)。

免疫組化結(jié)果的判讀：CD163標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞,胞質(zhì)棕黃色判讀為陽性,在400倍鏡下,每張切片至少連續(xù)計(jì)數(shù)9個(gè)高倍視野,再取其平均值[4]。TGF-β1表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì),呈棕黃色；E-cadherin陽性著色位于腎小管上皮細(xì)胞的胞膜,棕黃色,為上皮標(biāo)記物；Vimentin表達(dá)于間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì),為間質(zhì)標(biāo)記物；SMA標(biāo)記活化的肌纖維母細(xì)胞,胞質(zhì)棕黃色為陽性。陽性區(qū)域計(jì)算方法：在200倍鏡下,每張切片至少計(jì)數(shù)6個(gè)中倍視野的腎實(shí)質(zhì),避開腎小球和大血管。將所選視野用蔡司顯微鏡進(jìn)行拍照,再將圖片輸入Imagepro plus 6.0圖像處理軟件對(duì)圖片進(jìn)行定量檢測(cè)各種蛋白的平均光密度值,即為TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 CD163、TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA在移植腎組織和正常腎組織中的表達(dá)CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞、TGF-β1、Vimentin和SMA在移植腎組織中的表達(dá)顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化程度的加重,它們的相對(duì)表達(dá)量也逐漸增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05,表1、圖1)。

上皮標(biāo)記物E-cadherin在移植腎腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于正常腎組織,并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化級(jí)別的升高其表達(dá)逐漸減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1、圖1)。

2.2 患者血肌酐和血尿素氮水平與移植腎組織間質(zhì)纖維化程度的關(guān)系患者的血肌肝(creatinine, Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)平均值隨移植腎間質(zhì)纖維化程度的增加而升高,與正常人的血Cr相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表1 各級(jí)纖維化的移植腎組織中SMA、CD163、E-cadherin、TGF-β1和Vimentin的相對(duì)表達(dá)

纖維化程度例數(shù)SMACD163E-cadherinTGF-β1Vimentin正常102.90±1.192.70±2.0567.06±10.221.20±0.64 2.66±3.35Ⅰ級(jí)1221.00±2.6991.50±25.3633.14±7.3051.56±20.5994.52±14.31Ⅱ級(jí)1039.00±4.6263.10±51.2518.34±3.00136.02±16.16138.05±11.83Ⅲ級(jí)863.75±9.22394.75±124.619.61±0.89214.02±17.35273.10±23.65F值246.872.7134.9316.4535.8P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 移植腎組織間質(zhì)纖維化程度及CD163、TGF-β1、SMA、E-cadherin和Vimentin在移植腎組織中的表達(dá)情況

A ：三色染色顯示移植腎組織間質(zhì)纖維化 (Masson,×200)；B：移植腎組織中M2型巨噬細(xì)胞在間質(zhì)中的聚集(EliVision,×200)；C：移植腎組織腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)TGF-β1陽性表達(dá)(EliVision,×200)；D：移植腎組織間質(zhì)標(biāo)記物SMA陽性表達(dá)(EliVision,×200)；E：移植腎組織腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)情況,部分腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)缺失(EliVision,×200)；F：移植腎組織腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin陽性表達(dá)(EliVision,×200)。

表2 患者血肌酐、BUN與移植腎纖維化程度的關(guān)系

纖維化程度nCr(μmol/L)BUN(mmol/L)正常1065.8±3.994.87±0.84Ⅰ級(jí)12172.75±24.5516.78±2.19Ⅱ級(jí)10266.20±27.9928.10±3.07Ⅲ級(jí)8447.88±48.5242.88±4.52F值277.4297.9P<0.001<0.001

Cr:肌酐；BUN：血尿素氮

2.3 移植腎組織中M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量與TGF-β1、E-cadherin、Vimentin和SMA表達(dá)及血Cr的相關(guān)性隨著移植腎間質(zhì)纖維化級(jí)別的升高,M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多,腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1和Vimentin及間質(zhì)SMA相對(duì)表達(dá)量也逐漸增多,而腎小管上皮細(xì)胞中的E-cadherin則逐漸減少。M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量與血Cr水平呈正相關(guān)(r=0.937,P<0.01,圖2)。

圖2 移植腎組織中CD163陽性的M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化各指標(biāo)及患者患者血清Cr水平的相關(guān)性

A：與間質(zhì)SMA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性；B：與腎小管上皮細(xì)胞Vimentin相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性；C：與腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性；D：與腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性；E：與患者血清Cr水平的相關(guān)性。

3 討 論

由于免疫抑制劑的合理應(yīng)用和手術(shù)水平的提高,腎移植已成為挽救腎功能衰竭患者生命的的重要手段。目前,腎移植近期效果已得到顯著的改善,但遠(yuǎn)期效果仍有待提高。CAI的發(fā)病機(jī)制還不清楚。巨噬細(xì)胞在多種腎疾病中聚集是一種普遍現(xiàn)象,包括炎癥性、非炎癥性腎疾病和移植腎損傷。研究表明巨噬細(xì)胞可以被極化成兩種不同的表型,即M1和M2。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎表型,其特征主要表現(xiàn)為產(chǎn)生多種促炎癥細(xì)胞因子,抵抗病原入侵,同時(shí)也會(huì)造成機(jī)體損傷,常見的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物有iNOS、CD86、CD16/32、白細(xì)胞介素-1受體(interleukin-1 receptor,IL-1R)等；而M2型巨噬細(xì)胞則是替代途徑活化的巨噬細(xì)胞,被認(rèn)為是抗炎表型,常與組織修復(fù)有關(guān),常見M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物有CD163、CD206、CD301等。隨著巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞,M1型可轉(zhuǎn)化為M2型,后者可以產(chǎn)生IL-10和TGF-β,誘導(dǎo)肌纖維母細(xì)胞的增殖,促進(jìn)纖維化的發(fā)生。調(diào)節(jié)從M1到M2轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵巨噬細(xì)胞受體是CD163,它是血紅蛋白清道夫受體[5-8]。

研究表明CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞與多種腎臟疾病的慢性損傷有關(guān),比如在糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)中,腎間質(zhì)浸潤(rùn)的M2型巨噬細(xì)胞與腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、DN分級(jí)和腎功能損傷有關(guān)[9]。有人用小鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型研究發(fā)現(xiàn)腎損傷后募集的巨噬細(xì)胞極化為M2型,M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)腎纖維化。消除M2型巨噬細(xì)胞可特異性地抑制腎纖維化,而消除M1型巨噬細(xì)胞則無此作用[2]。最近有一項(xiàng)關(guān)于巨噬細(xì)胞極化在移植腎抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的研究,實(shí)驗(yàn)分兩組,M1型巨噬細(xì)胞極化組和M2型巨噬細(xì)胞極化組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞極化組慢性移植性腎小球病變?cè)u(píng)分和血肌酐明顯升高,而腎小球率過濾明顯降低,與M1極化組比較,差異有顯著性意義[10]。本研究結(jié)果顯示CD163標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞在移植腎組織中的數(shù)量顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化程度的加重,M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量也逐漸增多,與前述研究結(jié)果一致,說明M2型巨噬細(xì)胞在移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展中也起著一定的作用。

M2型巨噬細(xì)胞是如何促進(jìn)移植腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的呢？眾所周知,EMT在腎間質(zhì)纖維化中起著重要作用。在EMT過程中,腎小管上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性,上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)減少,獲得間質(zhì)表型,遷移能力增強(qiáng),這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞從腎小管的微環(huán)境轉(zhuǎn)移至間質(zhì)內(nèi),促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,這些細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)標(biāo)記物SMA。有人將纖維母細(xì)胞與順鉑處理過的腎小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),順鉑只能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生不完全的EMT,而加入含有M2型巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基可以使順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生完全的EMT,進(jìn)一步引起腎小管間質(zhì)纖維化[11]。有兩個(gè)TGF-β超家族成員是腎小管上皮細(xì)胞可塑性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者：TGF-β1和BMP7,TGF-β1是EMT的潛在誘導(dǎo)者[12]。吳蓮鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞可通過誘導(dǎo)TNF-α高表達(dá)促進(jìn)腎組織早期炎癥損傷,M2型巨噬細(xì)胞通過提高TGF-β1水平促進(jìn)后期纖維增生性修復(fù)。另有研究表明,在輸尿管梗阻早期腎臟中募集的巨噬細(xì)胞主要是M1型,然而,這些細(xì)胞很快極化為M2型巨噬細(xì)胞,后者釋放大量的TGF-β1來提高EMT誘導(dǎo)的腎纖維化[14]。本研究結(jié)果顯示：移植腎組織腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1和間質(zhì)標(biāo)記物SMA的表達(dá)顯著高于正常腎組織,并且隨著移植腎間質(zhì)纖維化級(jí)別的升高而增多,而上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)則逐漸減少,同時(shí)發(fā)現(xiàn)間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)于CAI患者的腎小管上皮細(xì)胞中,并且隨著損傷程度加重其表達(dá)逐漸增多。這說明在移植腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT,TGF-β1與移植腎腎小管EMT有關(guān)。相關(guān)性分析顯示移植腎組織中M2型巨噬細(xì)胞與TGF-β1、Vimentin和SMA的表達(dá)呈正相關(guān),與患者血清Cr的平均值呈正相關(guān),而與E-cadherin呈負(fù)相關(guān),結(jié)合前人研究我們推測(cè)M2型巨噬細(xì)胞可能通過提高TGF-β1的表達(dá)水平來促進(jìn)移植腎發(fā)生EMT,進(jìn)一步促進(jìn)移植腎間質(zhì)纖維化,引起患者腎功能不全。

以往關(guān)于M2型巨噬細(xì)胞在腎臟EMT中的作用多集中在原發(fā)腎疾病或移植腎動(dòng)物模型上,本研究初步探討了M2型巨噬細(xì)胞在慢性移植腎腎損傷EMT中的作用,結(jié)果顯示M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)移植腎EMT的發(fā)生,引起腎纖維化和患者的腎功能不全,并且這一作用我們結(jié)合前人研究推測(cè)可能是通過提高TGF-β1的表達(dá)水平來誘導(dǎo)的。因此,我們認(rèn)為在臨床腎移植工作中可以定期檢測(cè)移植腎組織中M2型巨噬細(xì)胞的聚集情況來預(yù)測(cè)腎移植患者間質(zhì)纖維化發(fā)生的可能性,對(duì)臨床防止慢性移植腎腎損傷有著重要意義。