高盈 王瓊 梁官釗 佘曉東 史冬梅，2 沈永年 蘇曉紅 李冬梅，3 劉維達(dá)

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，江蘇省皮膚病與性病重點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042;2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟(jì)寧 272001;3.Department of Microbiology&Immunology, Georgetown University,Medical Center,Washington DC 20057,USA)

白念珠菌是女性生殖道的共生微生物，是外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis ，VVC)的最常見病原體，即使在免疫功能正常的個體中也可發(fā)病[1]。鑒于臨床進(jìn)展的差異以及感染部位的不同，人體陰道細(xì)胞抵抗白念珠菌病的機(jī)制在很大程度上仍然未知。

由Th1型CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫(Cell-mediated immunity ，CMI)被認(rèn)為是抵抗白念珠菌感染的主要宿主防御機(jī)制[2]。然而，CMI并沒有顯示出對陰道念珠菌病的保護(hù)作用，因?yàn)閺?fù)發(fā)性VVC的婦女仍然可以維持Th1型CMI的正常水平[3]。近年來的研究表明，上皮細(xì)胞在宿主對真菌的免疫、共生/病原體識別、損傷修復(fù)等反應(yīng)中發(fā)揮著越來越重要的作用。處在黏膜最外表面的上皮細(xì)胞是最早接觸病原體的宿主細(xì)胞，負(fù)責(zé)識別并啟動對白念珠菌的免疫反應(yīng)。其中，白念珠菌的毒力因子在黏膜念珠菌病的發(fā)病機(jī)制中也起重要作用，包括凝集素樣序列3(agglutinin-like sequence3，ALS3)基因編碼蛋白(Als3p)和壓力相關(guān)蛋白-a1(Stress seventy related protein-al，SSA1)基因編碼蛋白(Ssa1p)。Als3p是糖基化磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定的糖蛋白，負(fù)責(zé)白念珠菌黏附到上皮細(xì)胞，從而誘發(fā)免疫反應(yīng)[4]。Ssa1p作為Hsp70家族的成員，分布在芽孢和菌絲表面，其作用與Als3p的作用類同，在與宿主細(xì)胞鈣黏附素結(jié)合后導(dǎo)致病原菌內(nèi)吞[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)ALS3敲除株在感染口腔上皮細(xì)胞中，其GM-CSF、G-CSF、IL-6、IL-1a的表達(dá)量較空白對照組降低[6]。但檢索中卻很少見到研究Ssa1p在誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子方面的工作。

為了更好地了解ALS3、SSA1基因?qū)Π啄钪榫T導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用，我們在體外研究了白念珠菌野生株及基因缺失株分別感染上皮細(xì)胞時各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)的差異，現(xiàn)報(bào)告道下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、菌株及主要材料

VK2/E6E7人陰道上皮細(xì)胞系由美國Raina Fichorova博士饋贈，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用添加50 μg/mL牛垂體提取物和0.1 ng/mL表皮生長因子的角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte serum-free medium，KSFM，Gibco，USA)傳代培養(yǎng)。白念珠菌SC5314作為本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)株(后文稱為WT)，購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Center, ATCC)，其ALS3基因缺失株(Δals3)、SSA1基因缺失株(Δssa1)均由衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)微生物菌(毒)種保藏中心真菌中心保存并提供。實(shí)驗(yàn)使用前，白念珠菌細(xì)胞保存于新鮮液體YPD(1%酵母提取物、2%培酮、2%D-葡萄糖)培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)時使其在30℃下再進(jìn)行2～4 h的對數(shù)相生長，經(jīng)收集、清洗、計(jì)數(shù)后用于實(shí)驗(yàn)。主要設(shè)備： CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱，HQ45A恒溫?fù)u床，光學(xué)顯微鏡，微分干涉差顯微鏡(DIC)，倒置顯微鏡，MPEG圖像分析系統(tǒng)，全能酶標(biāo)儀。主要試劑：4%臺盼藍(lán)溶液。Cyto Tox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒。人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA檢測試劑盒，人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)ELISA檢測試劑盒，人白介素-1α(IL-1α)ELISA檢測試劑盒，人白介素-8(IL-8)ELISA檢測試劑盒。

1.2 芽管形成實(shí)驗(yàn)

將SC5314(WT)、Δals3和Δssa1的孢子分別加入含1 mL KSFM的24孔板中，在含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)2 h，觀察芽管的形成。利用微分干涉差顯微鏡(differential interference contrast microscopy， DIC)對每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8～10個視野的隨機(jī)成像。采用MPEG圖像分析系統(tǒng)(MShot Image Analysis System)對芽管長度進(jìn)行測量。

1.3 不同白念珠菌對上皮細(xì)胞的損傷作用

將1×106個陰道上皮細(xì)胞接種于6孔板，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=0.01感染念珠菌孢子后共培養(yǎng)24 h，用0.2%臺盼藍(lán)液染色細(xì)胞并取圖。

以MOI=0.01～1的比率分別共培養(yǎng)白念珠菌孢子及陰道上皮細(xì)胞，24 h后測定上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量，用以評估上皮細(xì)胞損傷程度。實(shí)驗(yàn)使用Cyto Tox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega，美國)進(jìn)行。細(xì)胞損傷的計(jì)算公式如下：細(xì)胞毒性%=(實(shí)驗(yàn)組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)/(靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放)×100%。

1.4 細(xì)胞因子及趨化因子的檢測

處理上皮細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105cells/mL，接種于6孔板中，每孔2 mL，置 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁成單層。分別加入MOI為0.01、0.1、1的白念珠菌孢子，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。24 h后吸取培養(yǎng)液，離心后以酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)實(shí)驗(yàn)步驟檢測上清液中細(xì)胞因子(G-CSF、GM-CSF、IL-1α)、趨化因子(IL-8)的產(chǎn)生。結(jié)果用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定各孔的光密度(OD 值)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析對上述結(jié)果進(jìn)行分析。

以用P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同菌株芽管長度的差異

與SC5314和Δals3相比，在KSFM培養(yǎng)基中37℃、5%CO2培養(yǎng)2 h后，Δssa1平均芽管長度為4.2±1.8 μm，與其他兩個菌株相比減少約30%～40%(P<0.001)；Δals3芽管長度較WT無明顯變化(見圖1A)。然而，這兩個突變體的芽管的形態(tài)都不能與野生型菌株(見圖1B)區(qū)分開。

2.2 不同菌株對上皮細(xì)胞損傷的差異

用臺盼藍(lán)染色法直觀評價菌株對上皮細(xì)胞的損傷。顯微鏡下，損傷的上皮細(xì)胞易于與野生型和突變型菌株的菌絲聚集分布(見圖2A)，如我們在高倍鏡下看到的(見圖2B)。與野生型相比，Δssa1突變體在MOI=0.01、共孵育24 h后對陰道細(xì)胞的損傷力明顯降低，死亡細(xì)胞明顯較少(見圖2A、B)，Δals3突變體感染較野生型無明顯變化。

使用LDH測定法進(jìn)一步評估不同菌株對上皮細(xì)胞的損傷能力。如圖3A所示，無論感染哪種菌株，陰道細(xì)胞的細(xì)胞損傷都隨著感染比率的增加而增加(P<0.05)。圖3B中Δssa1突變體的細(xì)胞毒性作用小于野生型，且隨著感染比率的增大其差異有更明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而相較于Δssa1，Δals3突變株在與WT同感染比率時，其對上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性反而略有增高(MOI=0.1、MOI=0.01時P<0.05)。

2.3 細(xì)胞因子及趨化因子的檢測

在本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)4種待測因子在WT感染上皮細(xì)胞時，因感染比率的不同其產(chǎn)生量也不盡相同，其中GM-CSF、IL-8在MOI=0.01時可誘導(dǎo)最大分泌量，而G-CSF、IL-1α的最大分泌量則分別出現(xiàn)在MOI=0.1、MOI=10的感染狀態(tài)下。所以本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定不同菌株以上述不同感染比率感染上皮細(xì)胞，待24 h后檢測細(xì)胞促炎因子(G-CSF、GM-CSF、IL-1a)及趨化因子(IL-8)的產(chǎn)生情況。

圖4A的結(jié)果表明，MOI=0.01時，WT及Δals3菌株均可誘導(dǎo)陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生一定量的GM-CSF，而Δssa1菌株幾乎不誘導(dǎo)GM-CSF的產(chǎn)生，突變株誘導(dǎo)GM-CSF的能力均減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖4B的結(jié)果表明，MOI=0.1時，WT及Δals3、Δssa1菌株均可誘導(dǎo)G-CSF，但突變株誘導(dǎo)GM-CSF的能力均減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖4C、D的結(jié)果表明，MOI=1時，WT及Δals3、Δssa1菌株均可誘導(dǎo)IL-1α；MOI=0.01時，WT及Δals3、Δssa1菌株均可誘導(dǎo)IL-8，但突變株的誘導(dǎo)兩種因子的能力均減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

黏膜上皮細(xì)胞是黏膜最外層的細(xì)胞，是抵御白念珠菌感染的第1道防線，在抗白念珠菌感染方面也發(fā)揮著不可或缺的作用。黏膜與白念珠菌接觸誘導(dǎo)免疫的過程中，一個重要因素是上皮細(xì)胞的免疫活性。研究表明，上皮細(xì)胞可通過激活細(xì)胞免疫相關(guān)通路(如MAPK通路)及分泌多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子，募集中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等到感染部位，直接或間接的增強(qiáng)黏膜抗念珠菌的能力[7]。念珠菌感染誘發(fā)免疫反應(yīng)的另一個重要因素則與念珠菌的毒力因子等密切相關(guān)。如真菌胞壁上存在的黏附因子，其承擔(dān)著真菌對宿主上皮細(xì)胞黏附的作用，此過程影響著真菌致病的后續(xù)環(huán)節(jié)，有著尤為重要的作用。其中較為重要的白念珠菌侵襲素是Als3蛋白[8,9]及Ssa1蛋白[9,10]。它們存在于白念珠菌孢子或菌絲態(tài)上，與白念珠菌對上皮細(xì)胞的黏附與誘導(dǎo)內(nèi)吞功能有關(guān)。前期已有研究證明敲除ALS3可降低誘導(dǎo)口腔上皮細(xì)胞產(chǎn)生部分炎性細(xì)胞因子及炎性信號通路蛋白的表達(dá)[11]。但卻很少有實(shí)驗(yàn)研究ALS3敲除對陰道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的影響，及可能涉及到的炎性通路。也很少有實(shí)驗(yàn)研究SSA1敲除對上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞細(xì)胞因子的影響，及可能涉及到的炎性通路。且關(guān)于SSA1敲除對口腔或陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞細(xì)胞因子的影響及可能涉及到的炎性通路的研究也較為鮮見。為更好地理解白念珠菌對陰道上皮細(xì)胞的作用及其影響因素，我們進(jìn)行了此項(xiàng)研究。

圖1WT、Δals3、Δssa1芽管形成實(shí)驗(yàn)圖2臺盼藍(lán)染色圖3細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)圖4細(xì)胞因子檢測

Fig.1The germ tubes formation ofC.albicanswild type and mutantsFig.2Cell damage stained by trypan blueFig.3The cytotoxicity infected by wild type and two mutants at different MOI for 24 hFig.4Activation of chemokines induced byC.albicanswild type and mutants.

白念珠菌與上皮細(xì)胞的相互作用包括黏附和侵襲，前者需要白念珠菌侵襲素如Als3p和Ssa1p進(jìn)行宿主識別，而隨后的侵襲是通過受體介導(dǎo)的上皮細(xì)胞內(nèi)吞完成的。在吞噬的同時，白念珠菌可以分泌組織降解酶，如蛋白酶和磷脂酶來穿透上皮屏障。為了測試降解過程的結(jié)果，我們還檢測了乳酸脫氫酶釋放對上皮細(xì)胞的損傷。結(jié)果提示，相較于Als3p，Ssa1p更顯著的影響了這一過程。

分別用WT株及敲除組感染上皮細(xì)胞，鏡下觀察Δals3菌落生成形態(tài)及臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞的分布狀態(tài)，都并無明顯不同。由此可以得出，ALS基因的表達(dá)并不是唯一影響菌絲損傷細(xì)胞的因素；而SSA1基因的敲除很大程度上影響菌絲的生長延長，與其后實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對細(xì)胞損傷能力的減弱及誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的減少相一致。這些結(jié)果表明Ssa1p對于陰道細(xì)胞的侵襲和損傷是必需的，但Als3p不一定是必需的。

在臺盼藍(lán)染色結(jié)果中，菌絲周圍圍繞著較多死亡細(xì)胞，表明菌絲形成及其主動侵襲能力參與了白念珠菌對上皮細(xì)胞的損傷。已有研究證明白念珠菌Ssa1p和Als3p可通過與上皮細(xì)胞上存在的E-鈣黏蛋白受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)真菌內(nèi)吞。隨著SSA1和ALS3突變體的宿主內(nèi)吞作用減弱，它們對宿主細(xì)胞損傷的作用也不盡相同。我們發(fā)現(xiàn)，SSA1的缺失降低了白念珠菌的感染性，并導(dǎo)致陰道細(xì)胞的損傷也顯著減少，而Δals3似乎產(chǎn)生與野生型類似的變化。這些結(jié)果也一定程度上提示了陰道上皮細(xì)胞防御機(jī)制與相應(yīng)假定毒力因子之間的關(guān)系。

黏膜上皮細(xì)胞能夠釋放細(xì)胞因子以應(yīng)對病原體感染[12，13]。本研究中探索的細(xì)胞因子是基于它們是重要的調(diào)節(jié)、促炎或趨化細(xì)胞因子而選擇的。這些針對念珠菌感染的免疫細(xì)胞因子和趨化因子可用于募集和激活多種免疫細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。其中GM-CSF、G-CSF均為集落刺激因子，可作用于骨髓造血干細(xì)胞，促進(jìn)各種前體細(xì)胞分化成熟；刺激增強(qiáng)成熟的嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吞噬，并以刺激增強(qiáng)細(xì)胞毒活性等多種方式增強(qiáng)局部的免疫反應(yīng)[7,14]。IL-1α屬于促炎細(xì)胞因子家族，通常保留在細(xì)胞中，但在激活時釋放到體外，主要作用于白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素表達(dá)[15]。IL-8的釋放可以募集和激活中性粒細(xì)胞到黏膜感染部位[16]，從而觸發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。研究結(jié)果表明，與野生型相比，Δals3和Δssa1中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)均減少，其對細(xì)胞的損傷能力也相應(yīng)降低，表明該兩種基因與細(xì)胞因子應(yīng)答及念珠菌的黏附和侵襲能力均密切相關(guān)，其機(jī)制可能與相關(guān)細(xì)胞因子誘發(fā)的炎性信號通路有關(guān)，具體機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。